摘要
本研究旨在研究CD166与CSC的关系，并进一步探讨其潜在的作用机制。 本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 CD166对鼻咽癌细胞肿瘤干细胞样特性的影响 目的: 探讨CD166对鼻咽癌细胞肿瘤干细胞样特性的影响。 方法: 通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术构建CD166沉默和过表达的鼻咽癌细胞株，采用qRT-PCR和Westernblot检测CD166和干细胞相关基因(Bmi1、Oct4和Sox2)的mRNA和蛋白表达水平。细胞成球实验和裸鼠体内成瘤实验评估沉默CD166对鼻咽癌CNE-2R细胞的干细胞样特性的影响。 结果: 1.慢病毒载体转染技术成功构建沉默CD166细胞株(CD166-shRNA-CNE-2R)以及过表达CD166鼻咽癌细胞株(CD166-OE-CNE-2)。荧光倒置显微镜显示各组感染效率均在90％以上。qRT-PCR实验结果显示CD166-shRNA细胞中CD166基因mRNA表达水平明显下降(P＜0.001)，而CD166-OE细胞中转录水平明显升高（P＜0.001）。Westernblot检测结果与qRT-PCR检测结果相一致。 2.Westernblot和qRT-PCR实验结果显示，CD166-shRNA-CNE-2R中干细胞相关基因Bmi1、Sox2、Oct4的蛋白表达水平和mRNA表达量均低于NC-shRNA组和亲本CNE-2R组(P＜0.05)。与之相反，CD166-OE-CNE-2细胞中干细胞相关基因Bmi1、Sox2、Oct4的蛋白表达水平和mRNA表达量均高于对照组（Vector组）（P＜0.05）。 3.细胞成球实验结果显示，与NC-shRNA组和CNE-2R亲本细胞相比，CD166-shRNA-CNE-2R细胞形成的细胞球数目明显减少（P＜0.01），且CD166-shRNA组形成的细胞球体积较对照组小（P＜0.01）。 4.裸鼠体内成瘤实验显示沉默C166减弱了CNE-2R细胞体内的致瘤能力。CD166-shRNA-CNE-2R细胞形成的肿瘤体积(0.018±0.011cm3)明显小于NC-shRNA细胞所形成的的肿瘤体积（0.333±0.078cm3），P=0.008。 结论: CD166促进鼻咽癌细胞肿瘤干细胞样特性的形成，可能是鼻咽癌肿瘤干细胞阳性标记。 第二部分 CD166通过EGFR-ERK1/2信号通路调控鼻咽癌细胞肿瘤干细胞样特性的机制研究 目的: 明确CD166通过EGFR-REK1/2信号通路调控鼻咽癌细胞肿瘤干细胞样特性。 方法: Westernblot检测CD166沉默后CNE-2R细胞EGFR-ERK1/2通路蛋白的变化情况;免疫共沉淀(Co-IP)明确CD166与EGFR相互作用关系;EGFR通路刺激剂和抑制剂分别共培养CD166沉默细胞株CD166-shRNA-CNE-2R和过表达细胞株CD166-OE-CNE-2，Westernblot检测EGFR通路蛋白及肿瘤干细胞样相关蛋白的表达变化。 结果: 1.Westernblot结果显示，CNE-2和CNE-2R细胞的EGFR和ERK1/2蛋白表达水平无明显差异，但CNE-2R细胞中p-EGFR和p-ERK1/2的表达增加。 2.Westernblot结果显示，与NC-shRNA组与亲本细胞组相比，CD166-shRNA-CNE-2R中p-EGFR和p-ERK1/2蛋白质的表达水平下降，而EGF刺激后，p-EGFR和p-ERK1/2和干细胞相关蛋白的表达水平增加。 3.免疫共沉淀结果表明CD166与EGFR蛋白存在直接结合作用。 4.Westernblot结果显示，抑制EGFR信号通路下调了CD166-OE细胞的EGFR和ERK1/2磷酸化水平以及干细胞相关蛋白表达。 结论: CD166通过激活EGFR-ERK1/2信号通路促进CNE-2R细胞肿瘤干细胞样特性的表达。 第三部 分沉默CD166对鼻咽癌裸鼠移植瘤干细胞样特性及放射敏感性的影响 目的: 明确沉默CD166对裸鼠移植瘤的干细胞样特性及放射敏感性的影响。 方法: 构建裸鼠移植瘤模型，探讨CD166对鼻咽癌放射敏感性的影响，Westernblot实验和免疫组化检测CD166沉默后移植瘤干细胞样特性和EGFR-ERK1/2通路相关蛋白的表达变化。 结果: 1.裸鼠移植瘤模型结果显示，未照射时，CD166-shRNA组移植瘤较对照组生长速度减缓;在8Gy射线照射时，各组移植瘤生长均受到抑制，但CD166-shRNA组移植瘤抑制作用最明显;加入EGF刺激后，CD166-shRNA组移植瘤的抑制作用减弱。 2.Westernblot结果显示，与NC-shRNA相比，CD166-shRNA组移植瘤内CD166、干细胞样相关蛋白、p-EGFR和p-ERK1/2的表达降低。 3.免疫组化结果显示，CD166-shRNA组移植瘤中的CD166、干细胞相关蛋白，p-EGFR和p-ERK1/2的表达也降低，与Westernblot结果相一致。 结论: 沉默CD166降低裸鼠移植瘤的放射抵抗性和干细胞特性的表达。 第四部分 EGFR/p-EGFR预测鼻咽癌患者预后价值的Meta分析 目的: 为了评估EGFR通路分子的对鼻咽癌预后的影响及临床价值，本研究对EGFR/p-EGFR与鼻咽癌预后相关性的研究进行meta分析，评估鼻咽癌中EGFR/p-EGFR表达水平对其预后的影响。 方法: 本研究通过外文数据:Pubmed、Embase、Webofscience，以及中文数据库:中国知网(CNKI)及万方数据库中进行相关文献检索，截止日期为2020年11月5日。两名研究者分别根据研究的目的、研究对象、EGFR/p-EGFR表达和临床预后结局等指标制定纳入标准及排除标准并进行文献筛选，并对符合纳入的研究文献进行质量评估。然后对纳入文献中进行数据进行收集或提取，运用Stata(version13)软件对整理的数据进行统计分析。以风险比(hazardratio，HR)和95％可信区间(confidenceinterval，CI)作为EGFR/p-EGFR与预后结局的效应量进行Meta分析，并对异质性进行亚组分析及敏感性分析。运用Begg''s和Egger''s两种不同的检测方法对纳入的文献进行发表偏倚检测。 结果: 本研究共纳入20篇文献，共有1545例鼻咽癌患者;其中14篇来源于中国，3篇来源于韩国，1篇来源于日本，1篇来源于新加坡，1篇来自瑞典。纳入研究中，以EGFR为预测指标的文献有19篇文献，其中17篇文献包含以总生存期为预后评估指标，8篇文献包含以无病生存期为评价指标，2篇文献包含以无进展生存期为评价指标，5篇文献包含以无远处转移生存期为评价指标。以p-EGFR为预测指标的文献仅有3篇文献，其中3篇文献均包含了以总生存期为预后评估指标，而包含以无进展生存期为评价指标的文献仅有1篇，包含以无远处转移生存期为评价指标的文献2篇。Meta分析结果显示:EGFR的高表达与鼻咽癌患者的总生存期(HR=1.70，95％CI:1.24-3.15，P=0.001)和无病生存期（HR=2.58，95％CI:1.87-3.56，P=0.000）有关，而与鼻咽癌患者无进展生存期(HR=1.85，95％CI:0.90-3.82，P=0.09)和无远处转移生存期（HR=1.39，95％CI:0.73-2.67，P=0.319）无关。根据纳入研究所在国家（亚洲地区或者非亚洲地区）、样本量大小(＞100或者≤100)、免疫组化截止值（10％或25％）、病理类型（分化好或未分化）以及TNM分期((Ⅰ-ⅡvsⅢ-Ⅳ))对五个亚组进行分析。在TNM分期亚组分析中，Ⅲ-Ⅳ期所占比例高的研究中EGFR高表达预示总生存期更差(HR=2.27，95％:1.09-4.73，P=0.03)，但是各研究间仍存在异质性(I2=95.1％，P=0.000)。研究所在国家、样本量大小、免疫组化截止值、病理类型均不能作为EGFR预测总生存期的影响因素。敏感性分析显示未发现单独的研究存在EGFR表达对OS有显著影响，说明OS的研究中存在固有的异质性。EGFR与无病生存期之间研究异质性检测提示未存在异质性（I2=0％，P=0.606）。EGFR与无转移生存期之间研究异质性检测提示各研究间存在异质性(I2=82.8％，P=0.000)，在肿瘤分化好的亚组分析中研究的异质性I2下降至33.2％。而p-EGFR的高表达与鼻咽癌患者的总生存期(HR=1.00，95％CI:0.88-1.14，P=0.982)和无远处转移生存期(HR=1.21，95％CI:0.96-1.52，P=0.112)均无显著关联性。在异质性检测结中，p-EGFR与总生存期之间的研究异质性小（I2=38.4％，P=0.197）;p-EGFR与无远处转移生存期之间研究无异质性存在(I2=0％，P=0.497)。 结论: EGFR高表达预示鼻咽癌患者生存期缩短，可作为鼻咽癌预后的预测指标，而p-EGFR表达与鼻咽癌患者预后不存在显著相关性。
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