摘要
恶性肿瘤在确诊时大部分已为中晚期，切除率低，转移率高，预后不良等是导致患者生存率低的主要原因。科学家们逐渐将治疗方法转向了过继性免疫治疗，期望能有更好的治疗效果。CAR-T（Chimeric antigen receptor T-cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法），它的基本原理是抽取患者自身的外周血单个核细胞，并从中将T细胞培养起来，使它增殖，将CAR组装进T细胞后，再重新输回患者体内发挥作用来清除肿瘤细胞。它区别于其它免疫疗法的地方在于CAR-T是一种细胞疗法，不仅仅单纯的只是一种免疫制剂或免疫调节剂。在目前的临床试验中，CAR-T在血液瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗中表现出显著的疗效，已经成为免疫治疗的热点。 γδT细胞是T细胞的特殊存在：含量极少，TCR(T cell receptor，T细胞抗原受体)由γ和δ链组成，分布于机体的外周血和黏膜组织中。γδT细胞是具有多种结构和功能的异质性天然淋巴细胞的保守群体，它们在肿瘤进展过程中参与各种免疫反应，通过发挥直接的细胞毒性，产生强大的细胞因子和间接的抗肿瘤免疫反应来进行有效的肿瘤免疫监视。γδT细胞识别抗原不需要特异性抗原刺激，就可以快速识别外源性病菌和内源性应激配体，启动机体适应性的免疫应答。因为CAR-T在实体瘤治疗的局限性，所以我们寄希望于将普通T细胞换为γδT细胞，利用γδT细胞的非MHC限制性的免疫生物学特性。在单链抗体靶向肿瘤抗原后，一方面通过CAR上面的蛋白序列激活T细胞来发挥作用，另一方面利用γδT细胞非MHC限制性的识别抗原来激活体内免疫应答等生物学特性来改善CAR-T在实体瘤的治疗局限，获得更好的肿瘤治疗效果。 PD-1（Programmed cell death protein1，程序性死亡受体1）是位于T细胞表面的免疫球蛋白超家族的一种重要免疫抑制分子。PD-1蛋白与肿瘤细胞表面的PD-L1（Programmed cell death-ligand1，程序性死亡受体-配体1）蛋白结合能诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖，导致T细胞程序性死亡，从而使肿瘤细胞获得免疫逃逸。因此，阻断PD-1/PD-L1蛋白的结合是当前肿瘤免疫治疗的热点，阻断肿瘤细胞和T细胞的结合，使人体内T细胞能正常的发挥作用：持续地识别出人体内的肿瘤细胞并进行清除。为此，我们设计通过CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/associated nuclease9）基因编辑技术来定点敲除T细胞上的PD-1蛋白基因位点，沉默PD-1蛋白来阻止肿瘤细胞的免疫逃逸。 NRP1（Neuropilin1，神经菌毛蛋白1）是一种多功能的非酪氨酸激酶受体，在内皮细胞及多种肿瘤细胞表面高表达，在肿瘤血管生成，肿瘤细胞迁移，浸润及移植瘤的形成，肿瘤免疫抑制中均起到重要作用，被认为是抗血管生成治疗的潜在生物标志物。基于此，我们构建了以NRP1为靶点的CAR-γδT细胞，希望可以为现有的肿瘤免疫治疗提供更多的选择性。通过将NRP1特异性的嵌合抗原受体序列插入到γδT细胞中，同时敲除PD-1基因来阻断肿瘤细胞的免疫逃逸，构建一种靶向肿瘤血管内皮细胞的强力NRP1-PD1--CAR-γδT细胞，从而实现高效地靶向治疗实体肿瘤的目的。 目的： (1)探索培养诱导高比例γδT细胞的方法。 (2)探索构建将NRP1特异性的嵌合抗原受体序列插入到γδT细胞的PD-1基因位点，以沉默PD-1表达，从而构建靶向肿瘤血管内皮细胞的三代强力NRP1-PD1--CAR-γδT细胞的方法。 (3)体外验证效应细胞对靶细胞的杀伤效果。 方法： (1)在人PD-1基因位点设计sgRNA（Single-guide RNA，向导RNA），通过T7E1核酸内切酶来验证设计的sgRNA效率，得到最佳编辑效率的sgRNA。 (2)构建胞外段为NRP1的单链抗体，共刺激分子为CD28和4-1BB，胞内T细胞激活结构域为CD3ζ的三代CAR的功能序列，同时在CD3ζ序列后，使用T2A序列串联荧光标记mCherry。基于HITI（Homology-independent targeted integration，非同源重组末端插入技术）构建CRISPR knock in的供体质粒，在CAR-mCherry的片段两侧联入PD1-sgRNA，得到目的Donor质粒：PD1-sgRNA-EF1a-NRP1-CAR-T2A-mCherry-PD1-sgRNA。同样的方法在人AAVS1位点设计对照Donor质粒：AAVS1-sgRNA-EF1a-NRP1-CAR-T2A-mCherry-AAVS1-sgRNA。 (3)采用电转染的方式快速在γδT细胞上面打孔，将得到的目的质粒和RNP复合物电转入到γδT细胞中构建NRP1-CAR-γδT细胞，电转24h后，利用荧光显微镜观察是否有mCherry荧光表达，同时使用流式细胞仪检测荧光mCherry的表达率来验证目的质粒是否转入γδT细胞内。 (4)ELISA试剂盒检测各组效应细胞与靶细胞HepG2共孵育24h后细胞因子INF-γ、TNF-α的释放情况。 (5)显微镜下检测各组效应细胞对靶细胞HepG2的杀伤效果。 (6)流式细胞术检测各组效应细胞对靶细胞HepG2的杀伤作用。 结果： (1)成功地诱导出高比例的γδT细胞，比例达到90%左右。 (2)成功地构建了靶向NRP1的第三代CAR序列的质粒，采用电转染的方法制备NRP1-PD1--CAR-γδT细胞组及其对照组NRP1-AAVS1-CAR-γδT，在荧光显微镜下及流式细胞仪检测到mCherry的表达，表明NRP1-PD1--CAR-γδT细胞组及其对照组NRP1-AAVS1-CAR-γδT制备成功。 (3)体外验证了NRP1-PD1--CAR-γδT细胞实验组与靶细胞共孵育24h后所分泌的细胞因子INF-γ、TNF-α优于其余三组：γδT细胞，PD1--γδT细胞，NRP1-AAVS1-CAR-γδT细胞。 (4)体外同时也验证了NRP1-PD1--CAR-γδT细胞实验组对靶细胞的杀伤作用优于其余三组：γδT细胞，PD1--γδT细胞，NRP1-AAVS1-CAR-γδT细胞。 结论： (1)实验结果显示，用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功的将NRP1特异性的嵌合抗原受体序列插入到γδT细胞的PD-1基因位点，沉默了γδT细胞的PD-1位点，并成功地构建了三代的NRP1-PD1--CAR-γδT细胞。(2)体外实验验证了三代的NRP1-PD1--CAR-γδT细胞对靶细胞HepG2的杀伤效果。
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