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sRAGE在中性粒细胞哮喘发病中的作用和初步机制探讨
张晓波1
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摘要
哮喘是儿童最常见的慢性疾病，中性粒细胞性哮喘(NA)是以气道中性粒细胞炎症为特点的一种哮喘亚型，其存在不同的临床表型，被认为与哮喘气流不可逆受阻有关，激素治疗效果不佳。研究认为，儿童哮喘是成年期不可逆气流受限的危险因素。生命早期的不良状态（如哮喘等）及其导致的肺功能受损与成人慢性阻塞性肺部疾病（COPD）的发生存在关联。国外长期队列研究显示，儿童哮喘是COPD的危险因素，部分COPD的发生可能源于生命早期，并在儿童早期与哮喘样症状共享疾病机制，甚至有观点认为部分COPD可能是儿童期的疾病，只是在成人期表型变得明显。 NA以中性粒细胞气道炎症为主且与气流受限有关，而COPD同样是以气道中性粒细胞炎症及气流固定受阻为特点，故是否儿童NA有可能是COPD在儿童期的表型？为探讨NA和COPD的潜在联系，我们尝试寻找NA和COPD发病机制中的共同点。可溶性的晚期糖基化受体(sRAGE)是气道中性粒细胞炎症的预测指标，同时又是COPD的生物标志物，其在COPD患者血液及肺泡灌洗液(BALF)中低表达，且与COPD的病情严重程度分级以及肺功能负相关。是否sRAGE也参与了NA的发病，是否其在NA和COPD共同的病理过程中起作用？ 气道重塑是哮喘和COPD的共同病理特征，也是气流受阻的重要原因。哮喘患儿在婴幼儿期即可出现气道重塑，为探讨sRAGE在NA气道重塑中的作用，我们建立了NA小鼠模型，检测了sRAGE的基础表达，评估了sRAGE与NA小鼠气道重塑的关系。中性粒细胞气道炎症、炎症因子、粘液高分泌等均可致气道重塑，上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是气道重塑的机制之一，本研究通过过表达sRAGE探讨了其对上述因素的影响。体内实验存在较多分子交互，故通过体外实验在人气道上皮细胞（16HBE）对sRAGE的作用机制进行了研究，sRAGE作为诱饵受体可竞争结合RAGE的配体从而阻断配体/RAGE导致的致炎效应，高迁移率族蛋白B1（High mobility group box protein，HMGB1）是RAGE的配体且可通过RAGE/PI3K诱导气道上皮细胞发生EMT，我们探讨了sRAGE是否通过HMGB1/RAGE/PI3K调节16HBE细胞的EMT。 第一部分 sRAGE对中性粒细胞哮喘小鼠气道重塑的作用 目的:探讨sRAGE在NA小鼠模型中的表达水平及sRAGE对NA小鼠中性粒细胞气道炎症及气道重塑的影响。 方法:建立NA动物模型，ELISA法检测BALF中sRAGE的基础表达水平，探讨其与气道中性粒细胞炎症及气道阻力的关系。采用尾静脉注射过表达sRAGE的腺相关病毒载体转染NA小鼠模型，通过BALF细胞计数及细胞甩片Diff-quick染色了解sRAGE干预对小鼠气道中性粒细胞气道炎症及总炎性细胞的影响;通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)、过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff，PAS)染色、马松三色染色(Masson trichrome staining)，评估sRAGE对肺组织炎症细胞浸润、杯状细胞增生、平滑肌增生及胶原沉积等影响;Real time PCR、Western Blotting检测气道重塑相关指标的转录和蛋白水平表达，评估sRAGE对NA小鼠气道重塑的影响。 结果:1.NA小鼠BALF中sRAGE表达下降，而BALF的中性粒细胞计数及气道阻力增高。2.尾静脉注射过表达sRAGE的腺相关病毒小鼠肺组织绿色荧光蛋白表达明显增高。3.过表达sRAGE干预的NA哮喘模型组25mg/mL乙酰胆碱诱发的气道阻力较NA组下降。4.过表达sRAGE的NA小鼠的气道中性粒细胞炎症、肺组织炎症细胞浸润、杯状细胞化生及胶原沉积减轻。5.NA小鼠肺组织TGF-β1表达增高，sRAGE干预后表达下降;NA小鼠肺组织VEGF、MMP-9及α-SMA的表达与对照组未见明显差异。 结论:1.NA小鼠BALF中sRAGE低表达，且与气道中性粒细胞炎症负相关。2.尾静脉注射过表达sRAGE的腺相关病毒可有效转染小鼠模型。3.sRAGE可部分降低NA小鼠的气道阻力。4.sRAGE可抑制NA小鼠的气道中性粒细胞炎症、杯状细胞化生及胶原沉积。5.sRAGE可抑制气道重塑标志物TGF-β1的表达。 第二部分 sRAGE对中性粒细胞哮喘小鼠气道重塑的可能调节机制 目的:探讨sRAGE对NA小鼠气道重塑相关炎症介质、粘蛋白、气道EMT标志物及增殖凋亡自噬表型的影响，探讨sRAGE调节NA小鼠表型的可能机制。 方法:建立NA小鼠模型，通过尾静脉注射过表达sRAGE的腺相关病毒干预小鼠模型，ELISA检测sRAGE干预后NA小鼠BALF特征性炎症因子及粘蛋白表达变化，了解sRAGE对NA小鼠气道炎症因子及粘液高分泌的影响;Real time PCR检测sRAGE过表达后粘蛋白、增殖凋亡及自噬指标、EMT标志物、RAGE配体及RAGE、PI3K等信号通路分子的表达。建立HMGB1抑制剂、RAGE抑制剂及PI3K抑制剂干预小鼠模型，Real time PCR及Western Blotting检测EMT指标表达。 结果:1.NA小鼠BALF中IL-17和IL-6表达增高，sRAGE干预后IL-17和IL-6表达均下降。2.NA小鼠肺组织和BALF中MUC5AC和MUC5B的转录和蛋白表达增高，sRAGE干预组小鼠肺组织和BALF中MUC5AC和MUC5B表达均下降。3.NA小鼠肺组织E-cadherin下降而Vimentin表达增高，过表达sRAGE后E-cadherin表达较前增高而Vimentin表达较前下降。4.NA小鼠肺组织Ki67高表达而Bcl-2低表达，sRAGE干预后Ki67表达降低而Bcl-2表达增高;P62在NA小鼠肺组织低表达，但sRAGE干预后无明显变化;sRAGE干预前后NA小鼠肺组织Caspase3及LC3的表达无明显差异。5.NA小鼠肺组织RAGE配体HMGB1和SPARC表达增高，sRAGE干预后均下降。6.NA组小鼠肺组织RAGE、PI3K及p-ERK的表达增高，sRAGE干预后表达均降低;NA组β-catenin及JNK的表达下降，sRAGE干预后表达上升。7.HMGB1抑制剂、RAGE抑制剂及PI3K抑制剂干预组小鼠肺组织E-cadherin转录表达增高，而对Vimentin表达无明显影响。 结论:1.sRAGE可抑制NA小鼠BALF中IL-17和IL-6以及肺组织及气道MUC5AC和MUC5B的高表达。2.sRAGE减轻NA小鼠气道EMT。3.sRAGE抑制NA小鼠增殖蛋白Ki67的高表达及抗凋亡蛋白Bcl-2的低表达。4.sRAGE抑制配体HMGB1和SPARC的表达。5.sRAGE可调节通路分子RAGE、PI3K及p-ERK的表达。 第三部分 sRAGE调控人气道上皮细胞上皮间质转化的作用机制 目的:探讨sRAGE对人气道上皮细胞（16HBE）EMT的作用和可能机制。 方法:建立16HBE细胞体外培养体系，使用HMGB1诱导16HBE细胞EMT表型，Real time PCR检测上皮和间质标志物。通过sRAGE干预HMGB1诱导的16HBE细胞，检测划痕愈伤面积评估细胞迁移，检测上皮和间质标志物、下游信号传导分子、粘蛋白及相关炎症介质的表达，并用通路分子抑制剂进行回复实验了解其调控关系和其依赖的信号通路，探讨sRAGE对HMGB1引起的16HBE细胞EMT的作用机制。 结果:1.HMGB1诱导的16HBE细胞的E-cadherin表达下降而Vimentin表达增高。2.HMGB1干预的16HBE细胞迁移能力增强，HMGB1+sRAGE组细胞迁移能力降低。3.与HMGB1组比较，HMGB1+sRAGE组16HBE细胞E-cadherin表达增高而Vimentin表达降低。4.HMGB1处理的16HBE细胞RAGE、PI3K转录表达增高，sRAGE干预后表达均降低。5.与HMGB1组比较，HMGB1+RAGE抑制剂及HMGB1+PI3K抑制剂组16HBE细胞的E-cadherin表达增高而Vimentin表达降低。6.HMGB1干预的16HBE细胞粘蛋白MUC5AC表达增高，而MUC5B的表达无明显变化;与HMGB1组比较，HMGB1+sRAGE组、HMGB1+RAGE抑制剂组及HMGB1+PI3K抑制剂组16HBE细胞的MUC5AC表达下降。7.与对照组比较，HMGB1干预组TGF-β1、VEGF、MMP-9及α-SMA的转录水平表达未见明显差异。 结论:1.sRAGE可抑制HMGB1诱导的16HBE细胞的迁移能力。2.sRAGE可逆转HMGB1导致的16HBE细胞的EMT。3.sRAGE可抑制HMGB1导致的16HBE细胞的RAGE和PI3K转录表达。4.HMGB1可能通过RAGE、PI3K导致16HBE细胞的E-cadherin下降及Vimentin表达增高。5.sRAGE、RAGE、PI3K抑制HMGB1诱导16HBE细胞的MUC5AC表达。6.HMGB1对16HBE细胞TGF-β1、VEGF、MMP-9及α-SMA的诱导作用不明显。
关键词
中性粒细胞性哮喘/儿童患者/发病机制/可溶性晚期糖基化受体/气道重塑/气道上皮细胞/上皮间质转化引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
儿科学导师
农光民学位年度
2021学位授予单位
广西医科大学语种
中文中图分类号
R72