摘要
背景:宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，放疗是局部晚期宫颈癌主要的根治性治疗手段。随着放疗技术的进步，目前宫颈癌根治性放化疗已取得不错的疗效。但由于放疗抗拒的存在，仍然有一部分患者治疗效果欠佳，严重影响了患者的生命健康。因此，寻找新的宫颈癌放射增敏靶点显得尤为紧迫。而随着基因芯片技术及二代测序技术的广泛应用，利用生物信息学方法寻找放射增敏靶点已成为一种新趋势。研究者利用生物信息学方法对正常和肿瘤细胞的放射敏感性机制进行研究，鉴定出了255个与恶性肿瘤放射敏感性相关的标签基因。而且目前国内外尚无关于这255个标签基因与宫颈癌放射敏感性的研究。 目的:利用生物信息学方法，从这255个标签基因中筛选出参与宫颈癌放射敏感性调节的靶基因NQ01，同时在体内外验证NQO1基因干扰对宫颈癌SiHa细胞放射增敏作用并探讨潜在的作用机制。 方法: 1.使用癌症基因组图谱数据库(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)，利用生物信息学方法从255个标签基因中，筛选出在宫颈癌及宫颈正常组织之间差异表达的放射敏感性基因。然后利用单因素COX回归分析进一步筛选出与宫颈癌预后相关的差异表达放射敏感性标签基因，同时利用caretR包将整个数据集随机分成测试数据集和验证数据集，最后通过LASSO回归在测试数据集中进一步筛选并构建基于放射敏感性标签基因的预后风险预测模型，并在测试数据集及整个数据集中进行验证。还通过构建的预后模型计算每个患者的风险系数，探讨风险系数与患者预后的关系。 2.从参与构建预后预测模型的放射敏感性标签基因中筛选出目标基因NQO1，利用生物信息学方法探讨其在宫颈癌组织、细胞中的表达水平，以及其表达水平与患者临床基本特征的关系。通过计算相关系数构建NQO1共表达基因网络，利用GO功能富集以及GSEA通路富集探讨NQO1基因在细胞代谢中的功能及机制，初步论证通过干扰NQO1基因表达来调节宫颈癌放射敏感性的可行性。 3.在宫颈癌SiHa细胞中，以慢病毒技术为载体通过shRNA干扰NQO1基因表达，构建2个NQO1稳定低表达的宫颈癌SiHa细胞模型(分别为shNQO1-1、shNQO1-2)，并利用RT-PCR、Westernblot技术分别对构建的细胞模型进行验证。通过CCK-8法、线粒体势能法及流式细胞术检测干扰NQO1基因表达联合放疗对每组宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡的影响。采用克隆形成实验计算每组细胞的克隆形成率，并利用单击多靶模型拟合各组细胞的存活曲线、计算对应的放射生物学相关参数(D0、Dq、N、SF2)以及放射增敏比(sensitizationenhancementratio，SER)。还利用Westernblot技术探讨NQO1基因干扰，对PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响。 4.选用干扰效果较好的质粒构建宫颈癌异位裸鼠移植瘤模型，并根据干预因素的不同将裸鼠分为阴性对照组(shCont)、干扰组(shNQO1)、放疗组(IR)以及干扰联合放疗组(shNQO1+IR)。通过比较单纯放疗组、干扰联合放疗组之间裸鼠移植瘤的大小以及裸鼠存活时间，并进一步验证NQO1基因干扰对放疗疗效的促进作用。最后，利用Westernblot技术在移植瘤中验证NQO1基因干扰，对PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响。 结果: 1.在本研究中我们利用生物信息方法从255个放射敏感性标签基因中筛选出了与预后相关的9个差异的放射敏感性标签基因，并基于这9个标签基因利用测试数据集构建了宫颈癌预后风险预测模型，该模型能很好的预测测试数据集患者预后，并在验证数据集和整个数据集中进一步进行了验证。 2.从上述构建宫颈癌预后风险预测模型的9个基因中筛选出了目标基因NQO1，生物信息分析提示其在宫颈癌组织、细胞中均高表达，并与患者年龄、T分期有关，而与病理分级、N分期、M分期以及TNM分期无关。GO功能富集则显示其主要参与机体代谢、氧化还原反应等过程，GSEA通路富集则表明其可能通过激活DNA损伤修复来调节宫颈癌放疗敏感性。 3.在宫颈癌SiHa细胞中证实NQO1基因高表达，RT-PCR、Westernblot技术则分别从mRNA、蛋白质水平证实慢病毒介导的shNQO1干扰细胞模型中NQO1表达下调。并证实干扰NQO1基因表达增强放疗对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制、并进一步诱导细胞凋亡，提高细胞的放射敏感性。与对照组相比，干扰组shNQO1-1、shNQO1-2SF2均显著下降，差异有统计学意义，且两组的放射增敏比SER分别为1.269、1.511。 4.在动物水平证实NQO1基因干扰联合放疗同样抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。与单纯放疗组相比，干扰联合放疗组的移植瘤更小、裸鼠存活时间更长，差异有统计学意义，进一步验证了NQO1基因干扰可提高放疗疗效，实现放射增敏作用。 5.在机制研究过程中发现:干扰NQO1基因表达可以抑制宫颈癌SiHa细胞中PI3K、AKT蛋白水平的表达，并且该抑制作用在裸鼠实验中得到了进一步验证。 结论: 1.利用生物信息学方法筛选放射敏感性靶基因是一种可行的研究手段。 2.NQO1基因在宫颈癌SiHa细胞中高表达，干扰其表达能提高放疗诱导的抑制细胞增殖作用、促进细胞凋亡，并且提高SiHa细胞的放射敏感性。 3.干扰NQO1基因表达可能通过抑制PI3K/AKT通路激活来实现放疗增敏作用。
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