摘要
目的: 甲状腺癌在内分泌系统来源恶性肿瘤中最常见，其发病率日渐增加，成为全世界范围内患病率上升最快的肿瘤之一。甲状腺癌大多分化良好，恶性度低，通常预后良好。少数甲状腺癌表现出放射性碘抗性，高度侵袭性和/或远处转移，显著降低了患者的生存时间。在过去的几十年中，甲状腺癌发生发展过程中涉及的遗传学改变逐渐被揭示，包括BRAF和RAS基因点突变，RET和NTRK1酪氨酸激酶的融合。然而，仍然需要进一步探索侵袭性甲状腺癌中肿瘤产生恶性生物学行为的具体机制。 研究表明，恶性肿瘤细胞上皮-间充质转化(epithelia-mesenchymaltransition，EMT)是恶性肿瘤出现侵袭和转移的关键原因，也是恶性肿瘤进展的主要步骤。通过EMT促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。此外，上皮-间质转化后的细胞还获得对衰老和凋亡的抵抗能力。在甲状腺癌相关研究结果提示甲状腺未分化癌组织中EMT相关基因表达水平显著高于分化良好的甲状腺癌组织，表明EMT与甲状腺癌的肿瘤病理类型相关，在甲状腺癌侵袭性生物学行为中起着重要作用，进一步影响患者的预后。最近，越来越多研究揭示了甲状腺癌细胞中EMT的不同调节机制。 富亮氨酸α-2-糖蛋白1(LRG-1)作为富亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的一员很早就已被发现，但近十年来才受到重视及深入研究。研究显示，LRG-1是一种病理性血管生成调控因子，并可作为一种新的癌基因相关蛋白在多种肿瘤（膀胱癌、卵巢癌和胆管癌）中过度表达，并在脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移中具有重要作用。最近的研究揭示了LRG-1可通过激活HIF-1α促进结直肠癌细胞上皮-间质转化。然而，甲状腺癌发生发展过程中的生物学功能和潜在的分子机制尚未完全明确。 因此，本课题进行临床样本验证，研究LRG-1在甲状腺癌发生发展过程以及甲状腺癌细胞EMT过程中的作用，并进行体外细胞实验和体内成瘤实验，对LRG-1对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响作进一步验证。最后通过相关联信号通路的研究，初步探索LRG-1促进甲状腺癌细胞上皮-间质转化作用的可能相关分子生物学机制。 方法: 1.临床病理样本验证: 通过对NCBI下属的GEO高通量数据库甲状腺癌表达谱芯片数据中分析LRG-1在甲状腺癌的表达改变;运用荧光定量RT-PCR和WesternBlot方法检测LRG-1在纳入本研究的甲状腺癌患者的甲状腺癌组织和匹配的正常甲状腺组织中的转录和表达情况，进一步评估LRG-1和收集纳入甲状腺癌患者的临床病理特征、远期生存方面的相关性。 2.LRG-1影响甲状腺癌细胞上皮-间质转化的体外研究: 定量PCR检测了四种人甲状腺癌细胞系及一种正常人甲状腺细胞系(NTHY-ORI3-1)中的LRG-1表达水平。结果显示，四种甲状腺癌细胞系中，三种(75％)细胞系的LRG-1表达水平较正常甲状腺细胞系显著更高(p＜0.05)，其中HTC/C3和SW579细胞中LRG-1表达水平最高(p＜0.01);选择LRG-1高表达甲状腺癌细胞系HTC/C3和SW579细胞系，利用慢病毒构建基因敲低稳转细胞株，通过EdU细胞增殖检测和流式细胞术分别评估LRG-1对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响，通过Transwell侵袭实验和划痕试验检测LRG-1对甲状腺癌中侵袭和迁移能力生物学功能的影响;并通过实时定量PCR、WesternBlot方法和检测调控细胞上皮-间质转化过程的关键转录因子分析LRG-1是否影响甲状腺癌细胞的上皮-间质转化。 3.LRG-1影响甲状腺癌细胞上皮-间质转化的体内研究: 通过基因敲低甲状腺癌稳转细胞株、对照细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验。观察瘤体体积变化情况，第四周处死裸鼠后将瘤体称重，判断LRG-1对体内甲状腺癌细胞上皮-间质转化能力的影响。 4.LRG-1促进甲状腺癌细胞上皮-间质转化及迁移能力机制的初步研究: 检测在外源性LRG-1作用下甲状腺癌细胞的上皮细胞标记物和间质细胞标记物表达水平，判断LRG-1是否可诱导甲状腺癌细胞发生上皮-间质转化;检测在外源性LRG-1作用下MAPK/p38通路相关分子蛋白水平;检测在信号通路抑制剂作用下，细胞上皮-间质转化细胞标记物和MAPK/p38通路相关分子蛋白表达以及肿瘤细胞迁移和侵袭能力是否受到影响，以明确LRG-1通过激活MAPK/p38通路促进甲状腺癌细胞发生上皮-间质转化。 结果: 1.发现LRG-1基因在甲状腺癌中高表达，且LRG-1高表达与临床病理特征及预后相关 GEO高通量数据库生物信息学分析发现LRG-1基因在甲状腺癌中的表达水平显著高于正常甲状腺组织;共97例甲状腺癌患者纳入本课题，组织学和免疫组织化学检测显示，LRG-1在甲状腺癌组织中表达水平显著高于正常甲状腺组织过表达(p＜0.001)，并且肿瘤分期较晚和高LRG-1表达是甲状腺癌患者的两个独立预后因素，LRG-1表达水平较高的患者的无病生存时间显著较短(p＜0.01)，Logistic回归分析显示，LRG-1高表达与肿瘤分期较晚（HR=19.01，p＜0.001）及淋巴结转移(HR=43.94，p＜0.001)相关。 2.LRG-1促进甲状腺癌细胞的恶性生物学行为 体外研究表明，下调LRG-1表达能够显著抑制甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力，但不影响甲状腺癌细胞的增殖和凋亡。体内裸鼠成瘤实验移植瘤生长曲线结果说明LRG-1敲低抑制了裸鼠甲状腺癌移植瘤的生长(p＜0.001)。 3.LRG-1可诱导甲状腺癌细胞发生上皮-间质化 外源性敲减LRG-1作用下，上皮细胞标记物E钙粘蛋白表达上调，间质细胞标记物N-钙粘蛋白和波形蛋白表达下调，提示LRG-1可诱导甲状腺癌细胞系HTC/C3和SW579发生上皮-间质转化; 4.LRG-1通过MAPK/p38途径诱导甲状腺癌细胞发生EMT促进细胞的转移 外源性添加LRG-1剂量依赖性的促进p38磷酸化提示LRG-1促进MAPK/p38通路的激活;利用p38抑制剂抑制MAPK/p38通路后，LRG-1诱导的上皮细胞标志物下调和间质细胞标志物上调均被明显抑制，LRG-1诱导的细胞上皮-间质转化相关转录因子的表达被阻断，同时细胞划痕实验与Transwell细胞侵袭实验显示，LRG-1促进的甲状腺癌细胞生物学行为几乎完全消失。 结论: 1.LRG-1在甲状腺癌组织中转录和表达上调，并且LRG-1过表达与患者预后差和肿瘤分期较晚相关。 2.体外研究表明，LRG-1能够促进甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力但不影响其增殖和凋亡。 3.LRG-1还能诱导甲状腺癌细胞上皮-间质转化(EMT)。 4.LRG-1可选择性的激活甲状腺癌细胞中MAPK/p38信号通路，从而发挥其诱导甲状腺癌细胞迁移及EMT的生物学作用。 综上提示，LRG-1基因可能是一个甲状腺癌的癌基因。
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