摘要
背景：急性淋巴细胞白血病（AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)是血液系统恶性肿瘤，大多起源于B细胞，虽然化疗效果较可观，但仍有许多难治复发性ALL，且死亡率较高。作为一种新兴的免疫治疗方法，嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorsTCell,CART)技术的发展有目共睹，目前为止CART治疗肿瘤的临床研究主要集中在以CD19为耙点的血液系统恶性肿瘤方面，尤其在ALL的治疗中更是取得了令人欣喜的疗效，但仍有部分临床患者接受CD19CART治疗后无效或产生耐药。目前用于构建CAR的细胞外抗原识别结构域多为识别肿瘤相关抗原（Tumor-AssociatedAntigen,TAA)的单链抗体(SingleChainAntibodyFragment,scFv)片段，scFv易出现重轻链错配，铰链区需要优化，易团聚等问题。因此，寻找一种新型抗体并制备新型CART来改善复发或难治性ALL的疗效迫在眉睫。 目的：基于前期筛选的高特异性抗CD19纳米抗体，将CART细胞与免疫检查点阻断疗法相结合，构建基于分泌PD-1纳米抗体耙向CD19的新型抗肿瘤CART细胞(CD19-PD-1/NbCART)，验证当CD19-PD-1/NbCART细胞耙向肿瘤时，其分泌的PD-1纳米抗体将被递送至疾病部位，是否能减少与免疫检查点阻断相关的抑制作用，提高T细胞杀伤活性，为恶性血液肿瘤免疫治疗提供新的依据及策略。 方法： 1.设计CAR基因序列，分别为Mock、PD-1/NbCAR-Irrelevant-PD-1/NbCAR、CD19/NbCAR、CD19-PD-1/NbCAR5组;双酶切方案切割GV400慢病毒载体，完成目的基因与载体质粒连接;包装和浓缩慢病毒，通过荧光计数法计算慢病毒滴度。 2.分离培养人外周血T淋巴细胞，将收获的慢病毒转染T细胞以完成CART细胞构建;通过ELISA检测细胞培养上清中PD-1Nb的水平，使用荧光显微镜观察CART细胞的GFP表达情况;通过流式细胞术检测CART细胞中GFP以及Histag阳性细胞比例。 3.以未转染的T细胞(Utd)为对照，通过流式细胞术检测Utd组、Mock组、PD-1/NbCAR组、Irrelevant-PD-1/NbCAR组、CD19/NbCAR组、CD19/NbCAR+PD-1Nb组及CD19-PD-1/NbCAR组的CART细胞与耙细胞共孵育后的增殖情况以及表面活化分子CD25、CD69，记忆分子CD62L，溶酶体蛋白CD107a和胞内IFN-γ的表达。 4.采用流式细胞术检测CD19-PD-1/NbCART对B-ALL细胞Raji、K562-CD19、K562的杀伤作用，ELISA方法检测在培养上清液中CART细胞分泌细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10)的水平，ELISPOT检测CART细胞经CD19+细胞刺激后分泌IFN-y的T细胞数量。 5.构建NOD/SCID鼠荷B-ALL血液瘤模型(Raji模型)，随机分为PBS、Utd、Mock、PD-1/NbCAR、Irrelevant-PD-1/NbCAR、CD19/NbCAR、CD19/NbCAR+PD-1Nb和CD19-PD-1/NbCAR组。经尾静脉分别注射各组CART细胞和未转染T细胞后，观察荷瘤小鼠的生存率等指标判定CART细胞在体内的抗肿瘤作用。 6.构建NOD/SCID鼠荷B-ALL血液瘤模型(Raji模型)，随机分为PBS、Utd、Mock、PD-1/NbCAR、Irrelevant-PD-1/NbCAR、CD19/NbCAR、CD19/NbCAR+PD-1Nb和CD19-PD-1/NbCAR组。经尾静脉分别注射各组CART细胞和未转染T细胞后，流式细胞术检测第14天各组荷瘤小鼠脾脏中T细胞GFP的表达情况。 结果： 1.应用双酶切方案成功完成GV400慢病毒载体切割和基因重组，PCR法验证各组CAR基因均可成功插入载体;重组载体包装成慢病毒并浓缩后，最终收获的慢病毒滴度达到2×109-4×109TU/mL; 2.将构建好的慢病毒感染T细胞，荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光，流式细胞术同时检测到各组CART细胞的GFP及Histag表达率40%左右，表明CART细胞制备成功。 3.CD19-PD-1/NbCART细胞经CD19+耙细胞刺激后增殖活跃，增殖频率显著高于其余对照组;其细胞表面活化分子CD25-CD69，记忆分子CD62L，溶酶体蛋白CD107a表达较其余对照组增高，分泌IFN-γ的阳性细胞数较其余对照组显著上调。 4.CD19-PD-1/NbCART细胞可在体外显著杀伤CD19+的耙细胞，并且其杀伤效果随着效耙比的升高而增强，对高表达CD19(96.6%)的Raji耙细胞杀伤比例高于低表达CD19(42.2%)的K562-CD19细胞，对CD19-的肿瘤细胞则没有显著杀伤作用。当与CD19+耙细胞共培养时，CD19-PD-1/NbCART细胞上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的含量明显升高，IL-10的含量没有明显变化。 5.体内实验观察到CD19-PD-1/NbCART细胞治疗可显著抑制Raji血液瘤小鼠的肿瘤发展，延长小鼠的生存时间、提高存活率。 6.CD19-PD-1/NbCAR组小鼠的脾脏组织中T细胞GFP表达在尾静脉注射各组CART细胞的第14天后仍能保持一定表达，并均显著高于其余对照组。 结论：用慢病毒包装技术成功构建新型抗肿瘤CD19-PD-1/NbCART细胞，构建的CD19-PD-1/NbCART在体内体外具有一定的抗恶性血液肿瘤作用，为CART用于临床治疗提供了些许实验基础，也为恶性血液肿瘤的过继治疗提供了新策略。
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