摘要
本文从以下几个方面进行论述： 第一部分 过表达let-7e-5p对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响 目的： 前期对子宫内膜癌组织和癌旁组织标本进行高通量测序检测癌组织中高表达和低表达的miRNAs，let-7e-5p属于低表达miRNAs，并利用TargetScan、miRWALK等生信网站预测let-7e-5p的靶基因为CDKN1A，双荧光素酶实验已证实let-7e-5p靶向CDKN1A基因并抑制其表达。本文第一部分实验将研究在子宫内膜癌细胞Ishikawa中过表达let-7e-5p对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响。 方法： （1）合成Hsa-let-7e-5pmimics和Hsa-let-7e-5pNC，用脂质体LipofectamineTM2000将两者分别转入子宫内膜癌Ishikawa-GFP细胞系中，分为①blank组：未作任何处理的ISK-GFP细胞；②ISK-NC组：转染了hsa-let-7e-5pmimics阴性对照的ISK-GFP细胞；③ISK-let-7e-5p组：转染了hsa-let-7e-5pmimics的ISK-GFP细胞。培养24h~48h后，Real-timePCR检测hsa-let-7e-5p和靶基因CDKN1A的mRNA相对表达量验证mimics的效价。 （2）对①ISK-NC组：转染了hsa-let-7e-5pmimics阴性对照的ISK-GFP细胞；②ISK-let-7e-5p组：转染了hsa-let-7e-5pmimics的ISK-GFP细胞。进行细胞功能学实验： 1）用荧光显微镜观测1-5d的ISK-GFP细胞生长状态并拍照记录； 2）CCK8实验检测子宫内膜癌细胞Ishikawa在24h、48h、72h、96h、120h时于OD450nm处的吸光度值，并绘制CCK8增殖折线图反应增殖活力； 3）Transwell侵袭实验检测过表达let-7e-5p后Ishikawa的穿膜细胞数来反映侵袭能力的变化； 4）用流式细胞仪检测过表达let-7e-5p后Ishikawa细胞的细胞周期分布。 结果： （1）24h和48h，ISK-let-7e-5p组let-7e-5p的mRNA表达量都显著增加，CDKN1A的mRNA相应降低，说明过表达hsa-let-7e-5p可在mRNA水平抑制靶基因CDKN1A的表达，而且24h组的过表达效果较好，则选定最佳转染时间为24h，Real-timePCR鉴定let-7e-5pmimics转染成功。p＜0.05，差异有统计学意义。 （2）荧光显微镜下观察细胞状态和CCK8增殖曲线图结果：与ISK-NC组相比，ISK-let-7e-5p组细胞增殖能力明显提高。p＜0.05，差异有统计学意义。 （3）Transwell侵袭实验显示过表达let-7e-5p促进Ishikawa细胞侵袭，p＜0.05。 （4）流式细胞仪检测细胞周期结果：ISK-let-7e-5p组G1期细胞比例上升，S期变化不显著，G2期细胞比例相对下降。P＞0.05，差异无统计学意义。 结论： （1）进一步验证Ishikawa细胞中Hsa-let-7e-5p负向调控CDKN1A基因，符合前期双荧光素酶实验结果。 （2）过表达Hsa-let-7e-5p显著提高子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和侵袭能力，但是对细胞周期的影响没有统计学意义。 （3）细胞功能学实验结果为接下来探索过表达let-7e-5p可能通过何种分子机制来影响子宫内膜癌发生发展提供了研究思路。 第二部分 过表达let-7e-5p促进Ishikawa细胞增殖侵袭可能的分子机制 目的： 研究过表达let-7e-5p后促进子宫内膜癌细胞增殖侵袭可能涉及的作用机制，期许能为子宫内膜癌的筛查和诊断提供新的生物标志物。 方法： 用LipofectamineTM2000将hsa-let-7e-5pmimics和hsa-let-7e-5pNC分别转入ISK-GFP细胞。对细胞进行实验分组：①ISK-NC组：转染了hsa-let-7e-5pmimics阴性对照的ISK-GFP细胞；②ISK-let-7e-5p组：转染了let-7e-5pmimics的Ishikawa-GFP细胞。以Gapdh、U6为内参。 （1）用Real-timePCR测定与细胞增殖侵袭和上皮间充质转化有关的分子：bcl-2、p53、CDKN1A/p21、mmp-9、E-cadherin、vimentin、CyclinD1的mRNA相对表达量； （2）Westernblot检测bcl-2、p53、CDKN1A/p21、mmp-9、E-cadherin、vimentin、CyclinD1的蛋白表达水平。 结果： （1）Real-timePCR结果显示：ISK-let-7e-5p组与ISK-NC组相比，let-7e-5p（7.50±0.62）vs（1.00±0.05）、bcl-2（1.48±0.39）vs（0.99±0.12）、CyclinD1（2.50±0.28）vs（0.96±0.06）、mmp-9（2.93±0.47）vs（1.08±0.23）、vimentin（2.53±0.07）vs（0.94±0.05），这几个指标的mRNA表达水平相对上升。下降的指标有CDKN1A/p21（0.43±0.02）vs（1.00±0.04）、p53（0.39±0.03）vs（1.04±0.06）、E-cadherin（0.43±0.03）vs（0.95±0.04）。p＜0.05，差异具有统计学意义。 （2）Westernblot实验显示：ISK-let-7e-5p组与ISK-NC组相比，抗凋亡蛋白bcl-2（0.1593±0.000）vs（0.086±0.001）、细胞周期蛋白CyclinD1（0.3691±0.000）vs（0.3814±0.000）、mmp-9（0.3515±0.000）vs（0.2308±0.000）、vimentin（0.3182±0.000）vs（0.2079±0.000）这四个指标的蛋白表达水平相对升高；抑癌基因CDKN1A/p21（0.2273±0.000）vs（0.4095±0.000）、p53（0.2640±0.000）vs（0.5538±0.000）、上皮标志物E-cadherin（0.3910±0.000）vs（0.4312±0.000），这三个指标的蛋白表达量相对下降。(P＜0.05) 结论： （1）过表达let-7e-5p可能通过调节上皮间充质转化相关分子表达量，比如下调维持上皮稳定性的上皮标志物E-cadherin和降解细胞外基质的基质金属蛋白酶MMP-9，同时上调间质标志物vimentin来促进子宫内膜癌细胞向远处侵袭。 （2）let-7e-5p可能通过抑制细胞周期蛋白激酶抑制剂CDKN1A/p21对细胞周期的抑制和促细胞凋亡作用，联合上调细胞周期G1期“启动分子”CyclinD1和抗凋亡蛋白bcl-2表达水平，促进子宫内膜癌细胞增殖，加速肿瘤进程。
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