摘要
肝纤维化是由各种致病因素导致慢性肝损伤，引起细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)过度沉积的过程。肝星状细胞(Hepaticstellatecells，HSCs)占肝脏固有细胞总数的15％，在肝纤维化过程中起关键作用。在损伤因素作用下，HSCs转化为活化状态，分泌ECM及相关细胞因子，参与肝纤维化的形成。外泌体是大小为30-150nm的细胞外囊泡，可参与细胞间信息交换，在疾病诊断及治疗等方面发挥作用。为了准确了解肝纤维化过程中肝细胞外泌体内含物的差异，我们通过构建小鼠肝纤维化模型，分离正常及肝纤维化小鼠肝细胞，分别提取正常及肝纤维化小鼠肝细胞外泌体，筛选外泌体差异性miRNA的变化，深入探讨差异表达miRNA在肝纤维化过程中的作用机制，从而为肝纤维化的诊断及治疗提供可能的生物学标志及作用的靶点。基于以上研究目的，本课题从以下五部分进行相关研究。 第一部分 肝细胞外泌体对肝星状细胞活化的影响 目的:探讨正常及肝纤维化肝细胞外泌体对肝星状细胞活化的影响。 方法:(1)20％四氯化碳(Carbontetrachloride，CC14)腹腔内注射C57BL/6小鼠构建肝纤维化模型。(2)H&E染色明确肝组织病理改变。选取正常及肝纤维化组小鼠，胶原酶原位灌注法与密度梯度离心分别提取正常及肝纤维化组原代肝细胞及原代HSCs，光学显微镜下观察细胞形态，糖原染色、细胞角蛋白18(Cytokeratin18，CK18)免疫细胞化学染色鉴定肝细胞，α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)细胞免疫荧光鉴定HSCs。(3)收集人肝细胞系（L02细胞）、原代小鼠正常及肝纤维化组肝细胞上清，超高速离心法提取肝细胞外泌体，共聚焦显微镜观察人肝星状细胞系（LX-2细胞）对肝细胞外泌体的摄取情况，分别将L02细胞外泌体、原代正常及肝纤维化组肝细胞外泌体与HSCs共培养，24h后qRT-PCR检测HSCs中α-SMA、Ⅰ型胶原(TypeⅠcollagen，COL1A1)mRNA的表达情况。 结果:(1)C57BL/6小鼠经腹腔注射20％CC14后4-6周，肝组织H&E染色出现肝纤维化表现，8周时可见假小叶结构。(2)胶原酶原位灌注法可顺利提取小鼠正常及肝纤维化组肝细胞，肝细胞形态学，糖原染色及抗CK-18细胞免疫化学染色证实体外培养小鼠原代肝细胞纯度大于95％。胶原酶原位灌注法及密度梯度离心提取HSCs约1周左右细胞出现明显增殖，经免疫荧光染色，其α-SMA阳性率达90％以上。(3)超高速离心法可成功提取肝细胞外泌体，共聚焦显微镜观察肝细胞外泌体能被LX2细胞摄取，qRT-PCR结果提示，正常肝细胞系(L02细胞)外泌体能抑制LX-2细胞中α-SMA及COL1A1mRNA的表达(P＜0.05);与原代正常肝细胞外泌体组比较，肝纤维化肝细胞外泌体组HSCs中α-SMA及COL1A1mRNA的表达明显增高(P＜0.05)。 结论:肝细胞外泌体可被LX-2细胞摄取，与原代正常肝细胞外泌体组比较，原代肝纤维化肝细胞外泌体能促进HSCs活化及胶原的表达。 第二部分 肝细胞外泌体差异性miRNA的筛查及验证 目的:提取正常及肝纤维化肝细胞外泌体，高通量测序筛选正常及肝纤维化肝细胞外泌体差异性miRNA。通过qRT-PCR再次验证肝细胞外泌体中差异性miRNA的表达情况。 方法:(1)应用exoRNeasyMaxiKit提取正常组及肝纤维化组肝细胞外泌体，高通量测序技术检测2个组的基因表达谱，筛选2组的差异表达miRNA。基因本体(GeneOntology，GO)数据库以及京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)数据库对正常组和肝纤维化组肝细胞外泌体差异性miRNA的靶基因行通路富集分析;(2)qRT-PCR验证正常及肝纤维化肝细胞外泌体中差异miRNA的表达情况。 结果:运用exoRNeasyMaxiKit试剂盒可提取正常及肝纤维化组肝细胞外泌体，高通量测序结果示，两组肝细胞外泌体中差异性miRNA共38个。与正常组肝细胞外泌体比较，肝纤维化组肝细胞外泌体中上调miRNA有32个，下调miRNA有6个。差异表达miRNA靶基因GO及KEGG富集分析提示这些miRNA与肝纤维化相关。选定表达丰度高且组间差异明显的5个miRNA进行后续qRT-PCR验证。实验发现，肝纤维化肝细胞外泌体中miR-21a-5p、miR-30a-3p、miR-20a-3p、miR-143-3p、miR-199a-5p的表达显著高于正常肝细胞外泌体组(P＜0.05)，其中以miR-21a-5p的表达量最高，与高通量测序结果一致。 结论:肝纤维化肝细胞外泌体组miR-21a-5p、miR-30a-3p、miR-20a-3p、miR-143-3p、miR-199a-5p的基因表达较正常肝细胞外泌体组明显增高(P＜0.05)，以miR-21a-5p表达量最高，肝纤维化过程中，肝细胞外泌体可能通过向靶细胞传递miR-21a-5p而影响肝纤维化进展。 第三部分外泌体来源miR-21-5p与肝纤维化的相关性研究 目的:比较肝硬化患者及正常健康成人血清外泌体中miR-21-5p的表达差异，并通过动物模型，探讨血清外泌体miR-21-5p与肝组织病理学改变，HSCs的活化以及胶原的沉积是否具有相关性。 方法:(1)超高速离心法提取人血清外泌体，qRT-PCR检测人血清外泌体miR-21-5p的表达水平。(2)应用C57BL/6小鼠腹腔内注射20％CCl4构建肝纤维化模型，H&E、Masson染色检测肝组织纤维化程度，α-SMA免疫组织化学染色了解HSCs活化程度。(3)exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit提取小鼠血清外泌体，qRT-PCR检测小鼠血清外泌体及肝组织miR-21-5p的表达水平。 结果:(1))qRT-PCR结果显示，与正常健康成人组比较，肝硬化组患者血清外泌体中miR-21-5p的表达明显增高(P＜0.001)。(2)肝组织H&E染色证实肝纤维化的成功构建，Masson染色显示:与Normal组及Control组比较，模型组4周及8周肝脏胶原沉积阳性面积明显增加(P＜0.05);免疫组织化学染色示:与Normal组及Control组比较，模型组4周及8周肝脏α-SMA表达阳性面积明显增加(P＜0.05)。(2)qRT-PCR检测发现，在肝纤维化过程中，肝纤维化4周及8周小鼠血清外泌体及肝组织miR-21-5p的表达较Normal组及Control组明显增高(P＜0.05)。小鼠血清外泌体miR-21-5p的表达与肝组织miR-21-5p、α-SMA的表达及胶原沉积呈正相关(P＜0.01)。 结论:血清外泌体miR-21-5p的表达与HSCs活化、肝组织胶原沉积呈正相关，血清外泌体miR-21-5p可能作为肝纤维化诊断的生物学标志。 目的:通过双荧光素酶验证miR-21-5p是否与Smad7相应位点结合，从细胞水平探讨miR-21-5p调节HSCs的活化而促进肝纤维化的分子机制。 方法:(1)通过TargetScan网站预测miR-21-5p靶基因Smad7及其结合位点，构建Smad7的WT和MUT载体转染293T细胞，将细胞分为WT+NC组、WT+miR-21-5pmimics组、MUT+NC组和MUT+miR-21-5pmimics组，运用双荧光素报告酶实验验证miR-21-5p是否能与Smad7位点结合。(2)采用LipofectamineTMRNAiMAXTransfectionReagent将miR-21-5pmimic及miR-21-5pinhibitor转染LX-2，细胞分为:mimicNC组、miR-21-5pmimic组、inhibitorNC组及miR-21-5pinhibitor组，qRT-PCR法及WesternBlot法检测Smad7、α-SMA及COL1A1mRNA及蛋白的表达水平，CCK8、EdU法检测LX-2细胞的增殖能力。 结果:(1)通过miRNA靶基因预测网站查询到miR-21-5p与Smad7有结合位点。(2)双荧光素酶报告基因检测实验发现，WT+miR-21-5pmimic组的相对荧光素酶读数较WT+NC组显著下调(P＜0.0001)，下降29.28％;MUT+miR-21-5pmimic组的相对荧光素酶读数与MUT+NC组比较无明显差异。(3)qRT-PCR及WesternBlot结果显示，与mimicNC组比较，转染miR-21-5pmimic组α-SMA及COL1A1mRNA及蛋白的表达明显增高(P＜0.05)，Smad7mRNA及蛋白的表达明显下降(P＜0.05);与inhibitorNC组比较，转染miR-21-5pinhibitor组α-SMA及COL1A1mRNA及蛋白的表达明显下降(P＜0.05)，Smad7mRNA及蛋白的表达明显升高(P＜0.05)。(4)CCK8及EdU结果均证实，miR-21-5pmimic促进LX-2细胞增殖，而miR-21-5pinhibitor抑制LX-2细胞增殖。 结论:miR-21-5p可能通过抑制靶基因Smad7的表达，引起HSCs活化、增殖以及胶原的合成，从而促进肝纤维化发生发展。
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