摘要
目的：本课题研究的主要目的在于研发一种具有抗氧化能力的双网络水凝胶伤口敷料。良好的抗氧化性能有效减少氧化应激反应对细胞和组织带来的损伤，有效改善伤口处氧化还原微环境，促进伤口的再生修复；而双网络结构水凝胶的力学性能和稳定性更好，能为伤口愈合提高良好的环境。本研究提纯并改性了青蒿多糖（PolysaccharidesfromArtemisiaannuaL简称：HQG），得到了纯度较高的醛基化青蒿多糖（AldehydatedArtemisiaannuapolysaccharide简称：HQG-CHO），检测了改性前后青蒿多糖的理化性质。建立巨噬细胞氧化应激模型，探讨了HQG-CHO的抗氧化活性及分子机制。与此同时，通过用HQG-CHO与羧甲基壳聚糖（Carboxymethylchitosan简称：CS）以希夫碱反应形成的网络结构穿插于细菌纤维素(Bacterialcellulose简称：BC)三维网络结构的方法制备了双网络水凝胶，对其各项理化性质进行了表征并考察了这种水凝胶作为伤口敷料在大鼠皮肤全层缺损中的修复治疗作用。 方法：第一部分，通过对HQG的改性和提纯，得到高纯度的HQG-CHO。表征了HQG和HQG-CHO的含糖量、凝胶渗透色谱法（Gelpermeationchromatography简称：GPC）测定其分子量、傅里叶红外光谱分析了改性前后的基团、紫外扫描分析了其成分，高效凝胶液相色谱法（Highperformancegelliquidchromatography简称：HPLC）分析了其单糖组成。第二部分，研究了HQG-CHO的体外抗氧化性，首先检测了HQG-CHO材料的抗氧化性，测试了HQG-CHO水溶液的Zeta电位，然后检测了1、2、3、4、5mg/ml五个浓度HQG-CHO水溶液的总还原能力和ABTS自由基清除率；接着对HQG-CHO的在细胞内的抗氧化性进行了研究，采用1、2、3、4、5mg/ml五个浓度HQG-CHO处理细胞之后用CCK-8法检测其对细胞增殖的作用、用活死染色法研究了HQG-CHO的对细胞活性的影响；采用LPS诱导RAW264.7细胞产生氧化应激模型后，用不同浓度HQG-CHO处理细胞，并使用了流式细胞术（FlowCytometry）检测细胞中ROS的含量，以探究不同浓度HQG-CHO在细胞内的抗氧化作用；用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction简称：PCR）和免疫印迹法（Westernblot简称：WB）Nrf2/HO-1的基因和蛋白的表达以探索HQG-CHO细胞内抗氧化的分子机理。第三部分制备了BC/CS/HQG-CHO水凝胶，采用SEM分析水凝胶的微观形貌、热重分析检测其热稳定性，通过检测水凝胶的含水率、溶胀率、保水率检测了BC/CS/HQG-CHO水分的保持能力、检测不同频率下的储能模量、损耗模量测试了水凝胶的力学性能；细胞实验用中CCK-8法和活死染色测试了BC/CS/HQG-CHO的细胞相容性；用PCR法检测相关基因表达以研究BC/CS/HQG-CHO在细胞内抗氧化性能；最后在大鼠皮肤全层缺损模型中研究了BC/CS/HQG-CHO对伤口愈合的作用。 结果：第一部分HQG总糖含量为64.84%，水提醇沉法提纯后HQG-CHO总糖含量95.64%；HQG-CHO的氧化度为33%；HQG分子量为26612Da，HQG-CHO的分子量为20964Da；红外光谱分析图中HQG和HQG-CHO在波数为3289cm-1的附近有多糖的O-H伸缩振动，在2914cm-1附近有多糖的C-H伸缩振动；紫外扫描图中HQG和HQG-CHO在260nm和280nm处都未见核酸和蛋白出峰。第二部分对HQG-CHO的抗氧化活性进行了探究，发现当HQG-CHO浓度提高到5mg/mL时，其清除ABTS·自由基的能力比0.2mM/mlTrolox的1.28倍；HQG-CHO溶液的Zeta电位为-27.6mV是还原电位；在细胞实验中发现1、2、3、4、5mg/ml的HQG-CHO对细胞增殖有一定促进作用；在清除细胞内ROS实验中，与未经HQG-CHO处理的阳性对照组相比，实验组波峰明显左移，平均荧光强度也明显降低；经不同浓HQG-CHO处理RAW264.7巨噬细胞后可使Keap1基因表达随着浓度的升高而下降，而Nrf2与HO-1基因表达随着浓度的升高而升高。第三部分制备了BC/CS/HQG-CHO并进行了理化表征，SEM图中发现BC/CS/HQG-CHO纤维束更粗，孔径更致密；BC/CS/HQG-CHO的主要失重温度在223.6℃-602℃，308.1℃时达到最高失重速率48.3%，400℃时失重率为57.1%，结束失重的温度为602℃，剩余固体重量为15.5%；BC/CS/HQG-CHO含水率为93.01%，溶胀率为13.3%；BC/CS/HQG-CHO的储能模量在5Hz频率下可以达到37KPa；细胞实验发现BC/CS/HQG-CHO有良好的生物相容性能；在动物实验中，发现BC/CS/HQG-CHO水凝胶伤口敷料在大鼠全层皮肤缺损修复中，很好的促进了伤口的愈合。 结论：1.HQG-CHO在细胞内通过调节Nrf2/HO-1信号通路，上调HO-1基因的表达，促进HO-1的分泌，发挥抗氧化作用。 2.BC/CS/HQG-CHO形成的双网络结构具有良好的热稳定性、力学性能和锁水能力，这样的特性有利于BC/CS/HQG-CHO作为伤口敷料，为伤口提供良好的愈合环境。 3.BC/CS/HQG-CHO在皮肤全层缺损的大鼠模型中具有良好的修复效果。
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