摘要
目的探讨程序性死亡因子-1（PD-1）在肺缺血再灌注损伤（LIRI）发生中调控巨噬细胞极化的作用及机制。 方法1.24只SD大鼠随机分为空白对照组（Control组）、PD-1抑制剂组（BMS202组）、肺缺血再灌注组（I/R组）以及肺缺血再灌注组+BMS202（I/R+BMS202组），每组6只。用血管夹夹闭左肺肺门1h后再灌注2h建立大鼠LIRI模型；I/R+BMS202组大鼠于术前1小时经腹腔注射灌胃给予BMS202（5mg/kg）；BMS202组同时给予等量抑制剂；Control组不做任何处理。各组于再灌注后2h处死大鼠，剪取左肺组织，标记分组后测定肺湿/干重比值（W/D），苏木素-伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行肺损伤评分，电镜下观察肺组织超微结构改变，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、IL-6）水平，流式细胞仪检测M1巨噬细胞表面标志物CD86及M2巨噬细胞表面标志物CD206表达。将大鼠肺泡巨噬细胞分为5组：空白对照组（Control组）、阴性慢病毒转染对照组（NC组）、PD-1短发夹RNA慢病毒转染组（shRNA-PD1组）、氧葡萄糖剥夺再灌注组（OGD/R组）、氧葡萄糖剥夺再灌注+PD-1短发夹RNA慢病毒感染组（OGD/R+shRNA-PD1组）。将细胞氧和葡萄糖剥夺1h，再恢复供给2h建立细胞OGD/R模型。WB检测细胞中PD-1及HIF-1α蛋白的表达，ELISA检测细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的变化，流式细胞仪检测M1巨噬细胞及M2巨噬细胞表面标志物CD86与CD206表达。 2.为进一步探讨肺缺血再灌注损伤过程中，PD-1调控肺泡巨噬细胞极化的机制，我们通过应用PD-1抑制剂（BMS202）和转染慢病毒载体（shRNA-PD1）抑制PD-1，WB检测肺缺血再灌注动物模型和细胞模型中PI3K/AKT信号通路的表达，以明确PD-1通过介导PI3K/AKT信号通路活化参与肺缺血再灌注损伤；然后，进一步应用AKT抑制剂（LY294002），检测肺缺血再灌注后巨噬细胞极化情况，以证实PI3K/AKT信号通路对巨噬细胞极化的调控作用。24只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（Control组）、肺缺血再灌注组（I/R组）、PI3K/AKT抑制剂组（LY294002组）、肺缺血再灌注+PI3K/AKT抑制剂组（I/R+LY294002组），每组6只。除LY294002组及I/R+LY294002组外，其他组按实验一进行造模与干预，I/R+LY294002组于术前5分钟经尾静脉注射LY294002（0.3mg/kg），LY294002组注射等量抑制剂。采用流式细胞仪检测M1巨噬细胞表面标志物CD86及M2巨噬细胞表面标志物CD206表达，用ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。 结果1.与Control组比较，I/R组肺组织超微结构破坏严重，肺损伤评分、肺W/D比值及TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，M1型巨噬细胞极化标志物CD86表达明显升高。与I/R组比较，在给予BMS202预处理后肺组织形态学和超微结构改变明显改善，肺病理学评分降低，肺W/D比值及TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显下降，CD86表达明显下降。CD206在各组间的表达比较差异无统计学意义。Control组各项指标与BMS202组之间比较差异无统计学意义。体外实验中，与Control组及NC组相比，shRNA-PD1组细胞中PD-1的表达明显下降，病毒转染成功。与Control组相比，OGD/R组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，M1型巨噬细胞极化标志物CD86表达明显升高，HIF-1α表达明显上升，p-AKT表达明显下降。与OGD组相比，OGD/R+shRNA-PD1组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显下降，M1型巨噬细胞极化标志物CD86表达明显下降，差异均有统计学意义。在各组间比较CD206的表达差异无统计学意义。 2.WB检测示I/R后AKT磷酸化水平降低，在使用PD-1抑制剂进行干预后其磷酸化水平有所回升，在体外中也得到了相似的结果。与I/R组比较，I/R+LY294002组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，M1型巨噬细胞极化标志物CD86表达明显升高。差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Control组各项指标与BMS202组之间比较差异无统计学意义。 结论在肺缺血再灌注损伤中PD-1可通过调控巨噬细胞向M1型极化，刺激炎性因子的释放，导致肺内炎症反应和组织损伤，其作用机制与PD-1抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。
NETL