摘要
病菌侵入胸膜腔，产生脓性渗出液积聚于胸膜腔内的化脓性感染，称为脓胸。脓胸的发生多由肺部感染蔓延至胸膜腔所致，除此之外也可以继发于支气管肺癌、胸腔损伤、胸部手术、放置引流管等基础疾病或是医疗操作。革兰阳性菌、革兰阴性菌，厌氧菌、兼性厌氧菌等都可引起胸腔感染乃至形成脓胸，铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，P.a）也是脓胸的常见病原体之一。P.a因为其生物膜（Biofilm，BF）形成能力以及临床感染中表现出的耐药性而为人们所熟知。目前研究表明P.a的BF形成主要受不同的信号系统调控，如群体感应系统（quorumsensing，QS），环二鸟苷酸（Cyclicdiguanosine-5''-monophosphate，c-di-GMP）等。而胸腔感染中的P.a是否能够形成BF，若能形成BF，它是否受到c-di-GMP的调控尚未有新的报道。因此本研究的目的是探讨在新西兰兔脓胸模型中，c-di-GMP对P.a-BF形成的影响。本研究中，我们首先通过对健康新西兰兔进行胸腔穿刺注入P.a，并留置导管，建立了较为稳定的P.a脓胸模型。其次我们通过结晶紫染色，肽核酸荧光原位杂交（Peptidenucleicacid-Fluorescenceinsituhybridization，PNA-FISH）以及扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）等BF检测手段，证明了脓胸模型中，胸膜表面、胸腔留置导管，以及胸腔脓絮状物中均有BF形成，以此证明我们成功构建了脓胸P.a-BF感染模型。然后我们验证了c-di-GMP在体外实验有氧、厌氧环境中对P.a-BF形成能力的影响。最后我们使用胞内c-di-GMP低水平的PAO1/Plac-yhjH菌株、正常胞内c-di-GMP水平的PAO1菌株以及胞内c-di-GMP高水平的PAO1ΔwspF菌株分别建立脓胸模型，并对模型中的留置导管进行BF半定量，以比较上述三种菌株在脓胸P.a-BF感染模型胸腔中的BF形成能力，并探讨c-di-GMP对胸腔留置导管上P.a-BF形成的影响。 第一部分新西兰兔脓胸P.a-BF感染模型的建立 目的： 建立P.a新西兰兔脓胸模型，并探讨P.a感染的脓胸模型胸腔中是否有BF形成。 方法： 1.实验动物：雄性新西兰兔，体重为2.5±0.3kg，分为实验组和对照组。在广西医科大学动物中心清洁级条件适应性饲养1周。 2.体外悬浮菌液制备：实验菌株PAO1复苏，然后增菌、以OD600值调菌液浓度，并10倍系列稀释到所需要的浓度，备用。 3.手术：对各组新西兰兔进行麻醉、备皮，定位、消毒、铺巾、于第六肋间隙剪开皮肤，胸膜腔穿刺，置入导管，并注入上述菌液，对照组注入LB肉汤。清洁级环境饲养，以建立脓胸模型。 4.样本收集：当我们建立P.a感染所致的新西兰兔脓胸模型后。我们于术后第四天解剖模型新西兰兔，收集胸膜组织分别固定于10%甲醛溶液及3%戊二醛溶液中。收集胸腔脓絮状物固定于载玻片上。收集胸腔留置导管，生理盐水洗涤去除浮游菌后，装入无菌离心管中备用。 5.脓胸形成的验证：观察新西兰兔胸腔中是否脓絮状物形成，胸腔积液是否浑浊，是否存在胸膜组织粘连，采用HE染色观察胸膜组织炎症浸润情况，采用革兰染色在胸腔积液/脓絮状物中发现P.a。 6.胸腔BF形成的证明：将固定于甲醛溶液中的胸膜组织取材，石蜡包埋，切片，PNA-FISH观察BF；固定于戊二醛溶液中的胸膜组织进行SEM制样，SEM观察BF。脓絮状物固定于载玻片，PNA-FISH观察P.a-BF；留置导管浸入无菌生理盐水，经过漩涡震荡及超声震荡后，取浸洗液做菌落计数。 结果： 1.术后第四天解剖新西兰兔，可见实验组新西兰兔胸腔中有不等量脓絮状物及浑浊胸腔积液形成，壁层与脏层胸膜存在广泛的组织粘连。胸膜HE染色可见胸膜增厚及炎症细胞浸润；胸腔积液/脓絮状物中可见革兰阴性杆菌，即建模使用的P.a。 2．胸膜组织切片通过PNA-FISH可以观察到P.a-BF存在，但效果不理想。 3．SEM可观察到胸腔壁层胸膜上有生物膜样结构形成，但效果不理想，且寻找难度大。 4．胸腔脓絮状物通过PNA-FISH可观察到明显的P.a-BF。 5.胸腔留置导管的活菌计数和结晶紫染色证明胸腔留置导管中有P.a-BF形成。 结论： 通过注入P.a悬液及留置导管，可成功建立新西兰兔脓胸P.a-BF感染模型。该模型胸腔中，胸膜、胸腔脓絮状物及留置导管上均有P.a-BF形成，脓絮状物及留置导管上的P.a-BF更容易被观察到。 第二部分环二鸟苷酸对脓胸P.a-BF感染模型胸腔留置导管中P.a-BF形成的影响 目的： 分析体外实验中c-di-GMP对P.a有氧、厌氧环境下生长和BF形成能力的影响。探讨c-di-GMP对脓胸P.a-BF感染模型胸腔留置导管中BF形成的调控作用。 方法： 1.生长试验：将菌株PAO1/Plac-yhjH,PAO1,PAO1ΔwspF复苏，然后增菌、将菌液以OD600值调整至所需浓度，并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度，实验分为有氧及厌氧组，将调整好的菌液混匀、移入24孔板，封口膜封口，有氧组直接放在恒温摇床，厌氧组孔板置于厌氧袋中，再放于恒温摇床，37℃,180转/分钟，持续培养，测量每个观察时间点的OD600。 2.BF形成试验：将调整好的菌液混匀、移入96孔板，封口膜封口，有氧组直接放在恒温培养箱，厌氧组孔板置于厌氧袋中，再放于恒温培养箱，37℃，持续培养，24小时后，移除孔板内菌液，生理盐水冲洗3次，0.1%结晶紫溶液染色15min，移除结晶紫溶液，将孔板洗涤3次，常温晾干，33%冰乙酸脱色，多功能酶标仪测量OD570。 3.建模：使用胞内c-di-GMP胞内水平由低到高的菌株PAO1/Plac-yhjH、PAO1、PAO1ΔwspF分别建立新西兰兔脓胸模型。 4.样本收集：无菌操作下收集各组脓胸模型样本胸腔内的引流管，各截取2段相同长度（3cm）。 5.导管P.a-BF半定量：每个样本的其中一段引流管经灭菌生理盐水洗去浮游菌后，经过匀浆、漩涡震荡，将匀浆液进行培养计算菌负荷（CFU/ml）。另一段引流管剪碎，通过结晶紫染色对BF进行半定量。 6.统计学分析：采用spss22.0软件包分析，组间均数采用单因素ANOVA分析比较差异。 结果： 1.在有氧环境下三种胞内c-di-GMP水平不同的菌株在24小时阶段菌量相近。 2.24小时培养后，有氧环境下，胞内c-di-GMP水平不同的三种P.a菌株中，胞内c-di-GMP高水平的PAO1ΔwspF菌株BF形成量最多，而PAO1的BF形成量次之，PAO1/Plac-yhjH的BF形成量最少。厌氧环境下胞内c-di-GMP水平较低的PAO1/Plac-yhjH及胞内c-di-GMP水平正常的PAO1，均无明显BF形成，胞内c-di-GMP高水平的PAO1ΔwspF仅有少量BF形成 3.动物实验中，三组引流管活菌计数无明显差异。 4.动物实验中，三组不同菌株在导管中形成BF的量由低到高依次为PAO1/Plac-yhjH＜PAO1＜PAO1ΔwspF。 结论： 在体外有氧及厌氧环境中P.a-BF的形成受到c-di-GMP水平的调控。同时脓胸P.a-BF感染模型胸腔引流管表面P.a-BF的形成同样受到c-di-GMP水平的调控。
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