摘要
地龙，又被称为蚯蚓，在我国药用历史悠久，资源丰富，曾被记载在最早的中药学专著《神农百草经》中。地龙中蛋白质含量丰富，地龙蛋白在2009年被国家卫生部认定为“新资源食品”。已有众多研究表明地龙具有降血压、抗血栓、平喘止咳、促进创面愈合、抗肿瘤、免疫调节等功能活性。这些功能被认为与蛋白有关。氧化应激会导致细胞生物分子的氧化损伤。许多慢性疾病的产生如心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症都与氧化应激有关。地龙被报道具有抗氧化活性，但对其发挥抗氧化活性的物质基础尚未有清晰的认识，而且目前鲜有研究探讨地龙蛋白在制备抗氧化肽方面的潜力。为探究地龙抗氧化活性的物质基础，本论文采用体外消化模型研究了地龙蛋白经胃肠道消化降解后产生的抗氧化肽的氨基酸序列，并分析了其构效关系。同时，为了提高地龙蛋白的生物利用率，本文探讨了利用外源蛋白酶制备地龙抗氧化肽的可行性。本研究的主要结果如下： 地龙蛋白体外模拟胃肠消化后，所得胃肠消化产物（GEWP）具有较好抗氧化活性，其在2mg/mL浓度下对DPPH、ABTS自由基的清除率分别为28.14%，78.48%，ORAC值为0.3519μmolTE/mg，对氧化溶血的抑制率为87.4%。经DEAESepharoseFastFlow阴离子柱和SephadexG-25葡聚糖凝胶柱分离纯化后，利用LC-MS/MS鉴定纯化后组分中的多肽序列，一共鉴定出6,030条肽。 利用计算机模拟从上述6030条肽中筛选出活性评分最高的11条肽，并进行抗氧化活性验证。AFWYGLPCKL、WPWQMSLY、GCFRYACGAFY的综合抗氧化活性较好，对DPPH自由基的清除率分别为77.75%、25.07%、84.02%，对ABTS自由基清除率分别为88.96%、88.19%、89.72%，ORAC值分别为1.4、5.02、1.96μmolTE/mg，三个肽均能显著抑制AAPH诱导的红细胞溶血（P＜0.05）。应用量子化学中密度泛函法选取B3LYP/6-311G(d)基组对AFWYGLPCKL、WPWQMSLY、GCFRYACGAFY三条肽段的化学结构进行构效分析。根据各肽的HOMO分布、电荷分布等参数推测分子的活性位点。结果表明，AFWYGLPCKL的活性部位可能为位于Trp-3吲哚基上的N29-H108，释放活泼氢来实现抗氧化性；WPWQMSLY的活性部位可能位于Ser-6与Leu-7以肽键结合的位点；GCFRYAGGAFY的活性位点可能位于Tyr上酚羟基O122-H38，作为氢供体提供H38实现自身的抗氧化活性。 选用碱性、中性、菠萝、复合、木瓜五种蛋白酶对地龙蛋白（EWP）进行预酶解，结果表明碱性蛋白酶的酶解能力最强，EWP水解度为40.8%，显著高于其他酶解组分（P＜0.05）。地龙蛋白碱性蛋白酶酶解物（AH）抗氧化活性最优。对碱性蛋白酶预酶解的EWP模拟胃肠消化，EWP水解度为44.46%，显著高于直接消化的水解度（P＜0.05）。1mg/mL的GHEWP（预酶解消化产物）可显著抑制AAPH诱导的红细胞溶血，显著优于GEWP(P＜0.05)。GHEWP的DPPH清除率和ORAC值相较于GEWP分别提高了79.9%、120%。GHEWP经超滤分离后，取分子量＜3kDa的超滤组分进行LC-MS/MS分析，并筛选出11条抗氧化肽进行人工合成，验证其抗氧化活性。结果表明，其中抗氧化活性最好的肽是ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY。采用量子化学方法推测ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY的抗氧化活性位点，结果表明ATSGFFVY、HCFVLY、HRYSDF、HYANMY的活性位点可能分别位于Tyr-8、Tyr-6、Tyr-3、Tyr-2上，酪氨酸的酚羟基作为氢供体实现抗氧化作用；HLASGWY的活性位点可能位于Trp-6上，色氨酸上的吲哚基可作为氢供体。
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