摘要
乳腺癌是全世界女性常见的恶性肿瘤，近年来乳腺癌的发病率与死亡率都在逐年增加。如何预防和治疗乳腺癌对减少乳腺癌发病率、提高乳腺癌患者生存率及生活质量有重要意义。目前认为乳腺癌的发生与发展与多种因素相关，营养是其中较为确定的因素，一些营养素有抑制乳腺癌的作用。牛磺酸(Taurine，Tau)是一种含硫的非蛋白质结构的氨基酸，是一种条件必需氨基酸。在体内有多种生理功能，对机体的神经、心血管、免疫、内分泌代谢、运动系统等均有作用。近年来的研究表明，牛磺酸具有一定的抑制肿瘤作用，但相关机制仍未明了，可能与抗氧化，提高免疫力，诱导肿瘤细胞凋亡有关。我们的研究通过多种方法从不同的角度分析牛磺酸干预乳腺癌的相关机制，研究分成四个部分:（一）牛磺酸对大鼠乳腺癌发生的干预作用研究。我们用3％浓度的牛磺酸饮水干预乳腺癌大鼠，观察大鼠的肿瘤生长情况、高脂饲料对乳腺癌大鼠模型的作用、以及乳腺癌大鼠和牛磺酸干预乳腺癌大鼠全血十七种氨基酸的变化。（二）牛磺酸干预大鼠乳腺癌发生的代谢组学分析。我们对乳腺癌大鼠及牛磺酸干预后的乳腺癌大鼠进行代谢组学相关分析，从机体代谢变化这个角度对其机制进行分析，鉴定出乳腺癌大鼠及牛磺酸干预乳腺癌大鼠差异代谢产物和差异相关代谢途径。（三）牛磺酸干预大鼠乳腺癌发生的基因分析。我们利用实时荧光定量PCR技术，对其相关基因进行了研究，从基因这个角度分析牛磺酸干预乳腺癌的机制。（四）牛磺酸干预大鼠乳腺癌的肠道微生物检测分析。通过采集大鼠结肠内容物，提取DNA，进行高通量16SrDNA测序，探索乳腺癌大鼠肠道菌群改变，以及牛磺酸干预后乳腺癌大鼠肠道菌群的变化。 一、目的: 1、观察牛磺酸对二甲基苯蒽（DMBA）诱导大鼠乳腺癌模型的干预作用。 2、分析牛磺酸干预乳腺癌大鼠的血浆代谢组学变化。 3、分析牛磺酸干预大鼠乳腺癌组织的相关基因表达变化。 4、探索乳腺癌大鼠及牛磺酸干预后乳腺癌大鼠肠道菌群的变化规律。 通过研究分析初步探讨牛磺酸干预乳腺癌的相关机制，为牛磺酸在防控乳腺癌的研究方面提供基础理论依据。 二、材料与方法 1、SD雌性大鼠80只，随机分6组，1组（正常对照组）10只，2组（花生油灌胃组）10只，3组（DMBA致癌组）15只，4组(DMBA+高脂饮食组)，5组（牛磺酸干预DMBA致癌组）15只，6组（牛磺酸干预DMBA+高脂饮食诱导致癌组）15只。高脂饮食为饲料中添加5％猪油，牛磺酸干预为饮水中加入3％牛磺酸（食品级），予以大鼠自由饮食饮水。观察大鼠体重变化，肿瘤生长情况。16周后终止实验，处死全部大鼠，剥离肿瘤组织，留取血样。为了减少混杂因素，采用第1组、第3组，第5组大鼠标本进行牛磺酸干预机制的研究分析，第4组、第6组标本留做后续实验另做分析，第2组大鼠为DMBA溶剂对照组，实验结果表明花生油未对模型有作用，标本暂不做分析。取第1组正常对照组(n=10)、第3组DMBA致癌组(n=10)、第5组牛磺酸干预DMBA致癌组(n=10)大鼠全血利用全自动氨基酸分析仪进行十七种氨基酸分析。 2、取第1组正常对照组(n=10)、第3组DMBA致癌组(n=10)、第5组牛磺酸干预DMBA致癌组(n=8)组大鼠血浆，利用GC-MS方法进行代谢组学分析，利用OPLS—DA及T检验，分离鉴定出差异代谢产物，利用KEEG数据库分析差异代谢物相关代谢途径。 3、分别取第1组正常对照组(n=6)，第3组DMBA致癌组(n=6)，第5组牛磺酸干预DMBA致癌组(n=6)大鼠乳腺组织或肿瘤组织，提取组织RNA，逆转录成cDNA，利用实时荧光定量PCR技术进行检测，共检测7条大鼠乳腺癌相关基因:Akt1、Igf1、Igf1r、Pten、Myc、Hif-1a、HK-2基因。 4、分别取第1组正常对照组(n=8)，第3组DMBA致癌组(n=6)，第5组牛磺酸干预DMBA致癌组(n=5)组大鼠结肠内容物，提取DNA，利用高通量16SrDNA测序，探索乳腺癌大鼠肠道菌群改变，及牛磺酸干预乳腺癌大鼠肠道菌群的改变。 三、结果: 1、各组大鼠肿瘤发生率比较，第6组大鼠肿瘤发生率最高为i00％，第3、4组大鼠肿瘤发生率都为80％，第5组大鼠肿瘤发生率最低。各组大鼠潜伏期比较，第4组大鼠肿瘤发生的潜伏期最短，第5组的大鼠肿瘤发生的潜伏期最长。每组大鼠总荷瘤数及肿瘤大小比较，第6组大鼠总荷瘤数最多，第5组大鼠荷瘤数最少。计算每只大鼠肿瘤长径之和、长径×短径之和反映各组大鼠肿瘤大小，第4组大鼠肿瘤最大，第5组大鼠肿瘤体积最小。 第3组DMBA致癌组大鼠与第1组正常对照组大鼠比较，全血氨基酸中蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸水平升高，差异有统计学意义;天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸升高，差异没有统计学意义;苏氨酸、脯氨酸降低，差异没有统计学意义。第5组牛磺酸干预DMBA致癌组大鼠和第3组DMBA致癌组大鼠比较，全血氨基酸中全血氨基酸中蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸水平降低，差异有统计学意义，其余氨基酸水平降低，差异没有统计学意义。 2、分析鉴定出第3组DMBA致癌组大鼠与第1组比较有5种差异代谢产物，主要与氨基酸代谢及糖代谢有关。第5组牛磺酸干预DMBA致癌组与第1组正常对照组大鼠相比较，有23种代谢产物发生了变化，涉及的代谢途径有能量代谢，糖代谢，氨基酸代谢及核酸代谢。 3、第3组DMBA致癌组与第1组正常对照组大鼠相比较，Igflr、Pten基因乳腺癌组表达降低，Igfl基因表达升高，差异有统计学意义;Akt1、HK2基因、Myc基因、HIF-1a基因表达降低，差异没有统计学意义。 第5组牛磺酸干预DMBA致癌组与第3组DMBA致癌组大鼠相比较，第5组牛磺酸干预DMBA致癌组Peten基因、Igf1r基因表达升高，Igf1基因表达降低，差异有统计学意义;Akt1、Myc、Hk2、HIF-1a基因表达降低，差异没有统计学意义。 4、大鼠与正常人类肠道菌群是相似的，大鼠肠道菌群主要是厚壁菌门，其次是拟杆菌门，接下来是变形菌门、放线菌门和柔膜菌门。我们在实验中发现，第3组DMBA致癌组大鼠肠道菌群发生了改变，厚壁菌门6种细菌和正常大鼠比较有区别。第5组牛磺酸干预DMBA致癌组大鼠与第3组DMBA致癌组大鼠比较，厚壁菌门、变形菌门，放线菌门的12种细菌发生了改变。 四、结论: 1、牛磺酸对DMBA诱导的大鼠乳腺癌有明显的抑制作用。高脂饲料对DMBA诱导的乳腺癌模型有促进成模作用。乳腺癌大鼠、牛磺酸干预乳腺癌大鼠体内氨基酸发生了变化。 2、牛磺酸干预乳腺癌大鼠体内代谢发生了变化，代谢组学为进一步阐明牛磺酸干预乳腺癌的机制提供了线索。 3、牛磺酸干预大鼠乳腺癌肿瘤的作用表现为增加PTEN、Igf1r基因的表达，降低Igf1基因表达。乳腺癌大鼠的肿瘤发生机制可能与PTEN基因、Igf1r基因表达降低，Igf1基因表达升高有关。 4、乳腺癌大鼠肠道菌群发生了改变，可能与牛磺酸抑制肿瘤的机制有关。
NETL