摘要
目的：本文应用网络药理学方法获得白花丹醌（Plumbagin，PL）治疗结直肠癌（colorectalcancer，CRC）的“药物—靶点—蛋白—疾病”网络，探讨PL治疗CRC的核心药理作用靶点和主要生物过程、KEGG通路，对其作用机制进行预测。依据网络药理学的结果，进行后续临床病例观察与体外实验研究，验证作用靶点和标志物，为临床研究和治疗提供理论参考。 方法：1、首先利用TCMSP数据库找到药物成分，根据成分在SwissTargetPredict和SuperPred数据库、GeneCards数据库找出PL验证和预测的抗癌生物靶点。通过DisGeNET数据库和GeneCards数据库获得CRC相关靶点。分别得到药物靶点和疾病靶点后，用Funrich软件映射，取二者交集靶点，在STRING网站上进行PPI网络构建，得到蛋白互作图，随后导入Cytoscape软件对PL治疗CRC的靶点进行可视化，筛选核心靶点，最后使用DAVID数据库富集核心靶点，得到生物学过程和信号通路。2、收集临床患者的血清学资料和活检组织进行免疫荧光染色，对上述预测出的核心靶点进行癌组织标本定位。3、用人源HCT116细胞和SW620细胞分别用高浓度2.5μM、中浓度1.5μM、低浓度0.5μM的PL干预12h后观察其细胞毒性，使用DMSO作为溶剂对照组。4、使用CCK8法检测PL对细胞增殖抑制的作用。5、使用Hoechst33258染色法检测PL对细胞凋亡的影响。6、使用免疫荧光法和蛋白免疫印迹法（Westernblotting）检测PL干预后细胞的核心蛋白表达位置和变化。 结果：筛选出PL抗CRC的64个生物学候选靶点，绘制相关靶点的网络互作图，得到蛋白互相作用拓扑参数自由度最高的7个核心靶蛋白，分 别为：肿瘤抑制蛋白（Tumorproteinp53,TP53）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）、丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activatedproteinkinase1,MAPK1）、E1A相关蛋白p300（E1A-associatedproteinp300,EP300）、聚ADP核糖聚合酶1（PolyADP-ribosepolymerase1,PARP1）、核因子kappap65蛋白（Nuclearfactorkappap65protein,RELA）、Bcl-2样蛋白1（Bcl-2likeprotein1Bcl-2,BCL2L1），对上述核心靶蛋白进行通路富集分析，筛选PL治疗CRC的核心靶点相关的前20个生物学过程、KEGG信号通路。核心靶点所涉及的主要生物学过程为RNA聚合酶II启动子的转录、RNA聚合酶II启动子转录的负调控、细胞对DNA损伤刺激的反应等；涉及主要KEGG通路为胰腺癌、慢性粒细胞白血病、前列腺癌等。 临床患者血清统计学分析结果显示CRC病人肿瘤标志物癌胚抗原和糖类抗原CA199明显上升，血常规多项指标浮动较大。CRC活检标本IF染色显示，CRC肿瘤样本MAPK1、PARP1表达较明显，EP300表达较少。病人标本免疫荧光染色结果显示，癌症部位MAPK1和PARP1表达较多，EP300表达较少。CCK8实验显示PL干预下，HCT116细胞和SW620细胞增殖受到显著抑制，呈时间和剂量依赖性。细胞免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验结果显示，PL干预HCT116和SW620细胞均导致MAPK1、PARP1表达下调（P＜0.05），EP300表达上调（P＜0.05）。 结论：通过网络药理学研究得到PL抗CRC的64个作用靶点，筛选和验证其中的生物靶点和分子机制，部分核心靶点MAPK1、EP300、PARP1在临床标本和体外细胞实验中得到验证。这些生物靶点可能成为CRC检测和治疗的生物标志物。
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