摘要
背景： 宫颈癌（CervicalCancer，CC）是女性生殖道最常见的恶性肿瘤，2022年全国癌症报告显示宫颈癌患者数量仍高达11万，且呈现年轻化趋势，其严重威胁女性的身心健康和生命安全。放射治疗（Radiationtherapy，RT）是早期宫颈癌（具有高危因素）的辅助治疗及晚期无法施行肿瘤根治术进而控制肿瘤进展的有效手段，是当前临床不可替代的治疗策略。然而，由于癌细胞快速增殖导致肿瘤内部呈现乏氧状态，成为实体肿瘤放疗失败的主要原因[1]。研究表明，硝基还原酶（Nitroreductase，NTR）水平与肿瘤的缺氧程度呈正相关，使其成为肿瘤检测的一个新靶点[2]。因此，构建NTR响应的放疗增敏纳米平台成为重要研究课题。 光声成像（Photoacousticimaging,PAI）是一种新兴的医学成像方式，它将光学成像的出色分辨率和声学成像的深穿透性完美地结合，在癌症的早期发现、准确的诊断和精确的治疗评估方面均具有良好的应用前景[3]。目前，近红外二区（Thesecondnear-infrared,NIR-Ⅱ，1000-2000nm）窗口的PAI较可见光（400-700nm）及近红外一区（Thefirstnear-infrared,NIR-I，700-1000nm）具有更深的组织穿透、更高的光学分辨率和更低的背景噪声信号，在生物医学成像应用中引起越来越多的研究兴趣[4]。小尺寸纳米颗粒（NPs）到达肿瘤部位后很容易被清除，从而影响诊断成像和治疗的效果。因此，开发具有长期保留和富集作用的NIR-ⅡPA成像及增强放疗的多功能纳米材料变得尤为重要。 目的： 本研究旨在构建一种集诊断与治疗一体化的乏氧响应型多功能纳米材料，作为放射增敏剂响应NTR自组装形成聚集体提高肿瘤部位的富集和保留时间，实现肿瘤NIR-ⅡPA成像引导下的放疗增敏治疗。 研究方法： 1、首先制备具有核-壳结构的乏氧响应型AuNNP@PAA/NICNPs，通过动态光散射（Dynamiclightscattering，DLS）、透射电镜（Transmissionelectronmicroscope，TEM）以及紫外-可见-近红外吸收光谱（Ultraviolet-visible-near-infrared，UV-vis-NIR）、光声成像等对纳米材料进行表征并验证其对NTR响应性； 2、采用CCK-8法、活死细胞染色、凋亡流式细胞术测定AuNNP@PAA/NICNPs体外细胞毒性，通过γ-H2AX免疫荧光法进一步评估经X射线照射后DNA损伤情况，并利用DCFH-DA检测放疗后活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的产生；最后将AuNNP@PAA/NICNPs与不同氧浓度条件的细胞共孵育，观察细胞内聚集情况。 3、通过构建HeLa裸鼠皮下移植瘤模型，利用不同肿瘤体积（20mm3和60mm3）模拟常氧和乏氧肿瘤模型，进行NIR-ⅡPA成像并评估AuNNP@PAA/NICNPs的体内乏氧响应能力；确定体内肿瘤最佳富集时间后进一步评价AuNNP@PAA/NICNPs抗肿瘤治疗效果及其生物安全性。 研究结果： 1、成功合成了具有核-壳结构的AuNNP@PAA/NICNPs，UV-vis-NIR、TEM、DLS等结果说明该探针具有良好的NTR响应性，其响性对NTR具有浓度和时间依赖性。不同浓度NTR与纳米材料响应后光声强度之间具有良好的线性关系（y=0.036x+0.158，R2=0.994），可进一步用于NTR的定量测定。 2、探针在高达200μg/mL的浓度下HeLa和LO2细胞存活率分别为90.37%和93.33%，表明其具有良好的生物相容性。X射线肿瘤细胞毒性试验结果显示，在缺氧和常氧条件下，AuNNP@PAA/NICNPs+X-ray（4Gy）组HeLa细胞存活率分别为（45.2%和32.2%）显著低于单独X-ray组（62.1%和42.3%），说明AuNNP@PAA/NICNPs对乏氧及常氧肿瘤细胞均具有放疗增敏效果。活死细胞染色及流式检测结果与上述结果一致。此外，DCFH-DA荧光检测和DNA损伤实验表明，在肿瘤细胞内源性NTR响应后，AuNNP@PAA/NICNPs通过诱导肿瘤细胞产生ROS，促进肿瘤细胞凋亡和坏死。 3、在小鼠尾静脉注射6h后开始在肿瘤部位富集，乏氧肿瘤部位NIR-ⅡPA1200nm光声信号强度在24h达到峰值（光声强度从0.5增加到1.92，增加约3.84倍），说明AuNNP@PAA/NICNPs在乏氧肿瘤中发生自组装聚集进而实现NIR-Ⅱ光声成像。在HeLa荷瘤小鼠模型中，AuNNP@PAA/NICNPs+X-ray组较单纯X-ray组小鼠肿瘤生长受到明显抑制，说明AuNNP@PAA/NICNPs对宫颈癌小鼠具有显著放射增敏效果。小鼠体重未见明显变化且主要器官组织病理检测未见明显损伤，说明AuNNP@PAA/NICNPs纳米材料具有良好的生物相容性。 结论： 1、本论文成功合成具有乏氧响应型的核-壳型多功能金基纳米材料(AuNNP@PAA/NICNPs)，构建了可重复的纳米粒子制备流程，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供新思路。 2、本研究合成的小尺寸金基纳米颗粒具有深度肿瘤穿透性，到达肿瘤部位后发生化学交联形成纳米聚集体，延长了纳米颗粒在肿瘤病灶组织的高富集和长滞留，对于提高宫颈癌的放射增敏效果以及降低正常组织副损伤具有重要意义。 3、乏氧NTR响应聚集的金基纳米材料（AuNNP@PAA/NICNPs）展现出对宫颈癌NIR-Ⅱ光声成像引导下优异的放射增敏作用，为推动基于纳米平台介导的宫颈癌诊疗一体化模式和临床转化提供了一种新策略。
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