摘要
背景：结直肠癌（Colorectalcancer，CRC）是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2020年全球新增190多万新发病例以及90多万死亡病例，结直肠癌的发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的十分之一。由于结直肠癌早期症状并不明显，患者确诊时大多处于中晚期以至于预后较差。肿瘤标志物检测具有操作便捷、样本易获取以及非侵入性等优点，可以应用于癌症的早期筛查和预后评估。值得关注的是，国内外不少研究发现N6-腺苷酸甲基化（m6A）修饰水平异常发生于多种癌症中，可作为潜在的肿瘤生物标记物。有趣的是m6A修饰普遍存在于环状RNA（circRNA），并且该化学修饰对circRNA的生物学功能起到关键的调控作用，其中包括m6A介导circRNA翻译的起始阶段。 目的：本研究以circRNA为切入点，通过免疫共沉淀和微阵列技术检测结直肠癌和癌旁组织样本之间差异表达的m6A-circRNA，以寻找潜在的肿瘤标志物；同时利用生物信息学方法对其亲本基因进行预后和功能分析，并通过qPCR和蛋白免疫印迹技术进一步验证亲本基因在临床组织样本中的表达，为探讨结直肠癌发病的分子机制提供理论依据。 方法： （1）通过免疫共沉淀技术分别获取“Sup”RNA（未经m6A修饰）和“IP”RNA（m6A修饰），使用RnaseR对circRNA进行富集且“Sup”circRNA标记上Cy3和“IP”circRNA标记上Cy5，使circRNA片段化后进行芯片杂交。 （2）基于TCGA-COAD和GSE106582队列，挖掘结直肠癌在mRNA水平差异表达的基因；通过韦恩分析获取结直肠癌m6A-circRNA和mRNA表达下调的亲本基因进行基因功能富集和蛋白互作网络分析；使用Kaplan-Meier方法对亲本基因进行预后分析，并通过cBioPortal工具分析预后相关基因在结直肠癌中的基因突变。 （3）通过qPCR和蛋白免疫印迹技术探究TPM1和GAB1在结直肠癌组织样本中的mRNA和蛋白水平的表达，并通过Wilcoxon符号秩检验探讨TPM1表达与临床因素（二分类）的相关性。 结果： （1）结直肠癌和癌旁组织样本之间总共检测到2378个m6A-circRNA发生差异表达，其中结直肠癌组织样本有1694个m6A-circRNA表达下调，并且大多数差异表达的m6A-circRNA来源于外显子序列，其占比为81.75%。 （2）基于TCGA数据库，结直肠癌有3748个基因在mRNA水平表达下调；且基于GSE106582队列也发现结直肠癌有5048个基因在mRNA水平表达下调。 （3）9个亲本基因低表达与结直肠癌不良预后相关（P＜0.05），包括ABCD3、ABHD6、GAB1、MIER1、MYOCD、PDE8A、RPS6KA5、TPM1和WDR78，它们的基因突变率分别为4%、6%、5%、6%、10%、6%、6%、5%和8%，其中TPM1和GAB1在结直肠癌组织样本中的mRNA和蛋白水平表达下调，TPM1的表达与年龄、性别、临床分期以及淋巴结转移有关。 （4）KEGG功能富集分析发现m6A-circRNA和mRNA下调的亲本基因主要富集在肿瘤相关的信号通路，尤其是癌症蛋白聚糖和钙信号通络；基于MCC算法，通过蛋白互作网络分析这些亲本基因，发现TPM1是得分值最高的核心基因。 结论：结直肠癌组织样本中circRNA的m6A修饰水平发生改变，差异表达的m6A-circRNA可作为潜在的肿瘤标志物；并进一步发现TPM1可作为结直肠癌潜在的抑癌基因，其转录产物hsa_circRNA_035619的m6A修饰水平下调可能是结直肠癌TPM1异常表达的重要因素。
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