摘要
猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是一种无包膜的DNA病毒，直径大约为20纳米，属于圆环病毒科圆环病毒属。该病毒包括PCV1到PCV4四种基因型，其中PCV3和PCV4是近年来新鉴定的基因型。然而，由于缺乏纯净的病毒株，对其进行深入的研究受到了限制。因此，采用反向遗传技术对PCV进行拯救具有重要意义。反向遗传技术可以通过重新合成病毒基因组并将其转染到适当的细胞中，从而使得拯救的病毒株具有与野生型病毒相同的生物学特性。更深入地了解其生物学特性、病毒与宿主相互作用、致病机制等重要问题，有助于研发更有效的预防和治疗策略。反向遗传技术对于解决由于缺少纯化的PCV3和PCV4毒株导致的研究难题具有重要意义。 传统的病毒标记方法需要使用荧光染料或抗体，但这些方法有着诸多缺点，如荧光强度低、稳定性差、光热转换效率低等。近年来，量子点因其独特的物理性质和较高的荧光量子产率而成为一种新型的病毒标记物。量子点的荧光波长可调，可以被激发出高荧光强度的信号，从而实现对病毒的高灵敏度和高特异性检测。因此，使用量子点作为病毒标记物已经成为当前病毒学领域的研究热点之一。 基于上述现状，本文立足于反向遗传技术进行了以下一系列工作。 1.PCV4的拯救及在仔猪体内的感染研究 为获得PCV4拯救毒株，使用NCBI数据库中已报道的全长序列MT311854.1作为模板构建重组质粒pSK-PCV4，作为PCV4的感染性克隆。pSK-PCV4脂质体转染PK-15细胞48h后进行免疫印迹分析出现了预期大小的特异性条带，这证明了pSK-PCV4转染细胞后可进行正常表达预示成功拯救了PCV4的初代病毒。拯救出的病毒进行盲传培养至第四代过程中，PCV4的拷贝数一直保持稳定，说明拯救的PCV4病毒具有感染PK-15细胞和稳定传代的能力。收集PCV4P4代的病毒衣壳蛋白Cap进行WB检测，以及IFA检测，结果显示PCV4拯救病毒在多次传代后依然可以成功表达Cap蛋白，PCV4的感染性克隆构建成功。在透射电镜下观察到清晰的PCV4病毒颗粒，直径约为20nm，与预期一致。证实pSK-PCV4感染性克隆所产生的拯救病毒的组装过程正确，可以形成成熟的病毒颗粒。 PCV4拯救病毒通过鼻腔接种途径接种到5周龄的无病原体仔猪上后，PCR检测在不同组织中均发现了较高水平的PCV4拷贝数，进一步采用免疫组化对收集组织中的PCV4抗原进行检测，发现PCV4在肺、肝、淋巴结、脾、肾和大肠均广泛分布。并且在血液和唾液中也始终可以检测到PCV4的高水平表达。在实验组仔猪的肺、肝、脾、肾、淋巴结器官中均发生了肉眼和组织切片HE染色观察到的病变。最后在PCV4感染过程中仔猪产生了显著的PCV4抗体，并且多种细胞免疫因子表达水平身高。 2.PCV3的拯救及病毒的标记 使用NCBI数据库中已报道的全长序列MF318451.1作为模板构建重组质粒pSK-PCV3和pSK-PCV3-Avi。设计将Avi标签序列插入表达Cap蛋白的ORF2的N端。对于PCV3-Avi和PCV3的Cap蛋白分别进行模型建立，确定插入的Avi多肽（GLNDIFEAQKIEWHE）表达在病毒粒子表面。感染性克隆转染PK-15细胞后WB检测证明PCV3和PCV3-Avi重组病毒初步拯救成功。拯救病毒盲传培养至第四代过程中，病毒拷贝数一直保持稳定。随后通过WB和IFA检测P4代Cap蛋白表达，证明拯救病毒的蛋白表达正常，Avi标签不影响Cap蛋白和抗体的结合。电镜观察可以看到成熟的病毒颗粒，证明PCV3和PCV3-Avi生物学特性符合预期且增殖过程没有影响。之后通过Avi标记和生物素连接，以及生物素-链霉亲和素体系实现量子点对PCV的标记。通过IFA与激光共聚焦对量子点对PCV3-Avi在细胞水平的共定位标记进行验证，证明PCV3-Avi和量子点可以共定位。最后通过对小鼠皮下注射量子点标记的PCV3-Avi病毒，可以观察到在小鼠体内的扩散情况，说明可以通过QDs标记可以对PCV3在活体内的扩散方向、速度、靶向器官等致病性机制进行研究。 综上所述，研究一中本研究成功构建了感染性克隆pSK-PCV4，并通过将其转染到PK-15细胞中成功拯救出PCV4病毒。该病毒可有效复制且在仔猪体内进一步检测表明，拯救的病毒具有预期的生物学特性，可以感染仔猪多个组织并且具有一定的致病性，同时在体内也能引起显著的免疫反应。研究二中成功构建了PCV3和PCV3-Avi感染性克隆，拯救出PCV3和PCV3-Avi病毒并进行了生物学特性检测，证实了两种病毒增殖过程没有明显差异。研究还发现量子点可以有效标记PCV3-Avi，可用于该病毒感染的示踪分析。
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