摘要
背景： 黑色素细胞主要存在于毛囊、表皮和眼睛中，主要负责生成黑色素，这是头发以及皮肤色素沉着的基础。紫外线辐射（UVR）作为主要外在因素，可通过产生活性氧（ROS）来调节黑色素的生成，其中，UVB刺激启动黑色素的合成并导致色素在皮肤表面的积累，在产生色素沉着中发挥主要作用。前B细胞白血病同源盒基因(pre-B-cellleukemiahomeobox1,PBX1)，负责编码转录因子PBX1，在多种组织中广泛表达并在诸多发育生长过程中发挥其作用。PBX1不仅在胚胎发育中发挥重要作用，在许多器官中也发挥调控作用。本研究通过构建稳定过表达PBX1的PIG1细胞，并利用UVB构建黑色素生成模型，探讨PBX1对PIG1细胞生物学行为及功能的影响，并初步探究在UVB诱导黑色素生成模型中PBX1对PIG1细胞功能、黑色素生成及保护作用的影响。 目的： 研究转录因子PBX1对PIG1细胞生物学行为及功能的影响，并探讨PBX1在UVB致PIG1细胞产生黑色素、产生ROS及DNA损伤中的作用及作用机制。确保表皮黑色素细胞的存活、基因组稳定性及其正常功能，对于抑制色素障碍性疾病、肿瘤的发生至关重要。因此本研究试图全面了解PBX1在黑色素细胞中发挥的作用，更好地了解黑色素细胞的生物学及PBX1对黑色素细胞的作用及影响，为色素障碍性疾病及黑色素瘤的治疗提供理论依据。 方法： 1.利用慢病毒构建稳定过表达的细胞系；通过细胞计数法绘制细胞生长曲线图及克隆形成实验检验增殖能力；细胞划痕实验检测细胞迁移能力变化；流式细胞术检测细胞凋亡情况，并辅助WesternBlot法检测凋亡相关蛋白（PARP1、PAR、CleavedCasepase3、AIF、CytC）。 2.碱裂解法检测细胞黑色素含量；使用分光光度法检测酪氨酸酶活性改变；WesternBlot检测黑色素生成相关蛋白表达情况；DCFH-DA染料染色观察及流式细胞术检测ROS生成变化。 3.使用MTT法检测存活率；活细胞工作站观察细胞状态；碱裂解法检测黑色素含量及分光光度法检测酪氨酸酶活性，选择合适的UVB照射剂量建立UVB照射产生黑色素的模型。 4.UVB照射细胞后：碱裂解法检测黑色素含量；分光光度法检测酪氨酸酶活性改变；WesternBlot检测黑色素生成相关蛋白；DCFH-DA染料染色观察及流式细胞术检测ROS变化；碱性彗星实验检测DNA损伤情况；WesternBlot检测DNA损伤修复相关蛋白。 结果： 1.PBX1对PIG1细胞生物学的影响 过表达PBX1后：PIG1细胞增殖能力及克隆形成能力增强，迁移能力增强，凋亡率降低。 2.PBX1对PIG1细胞黑色素及ROS生成的影响 过表达PBX1后：PIG1细胞的黑色素量生成减少，并降低酪氨酸酶活性，黑色素生成相关蛋白表达下降，同时ROS生成减少。 3.UVB诱导黑色素生成模型 使用不同UVB照射剂量处理细胞，发现在90mJ/cm2细胞活力无明显差异，黑色素生成量最多，酪氨酸酶活性最强，因此选择90mJ/cm2作为实验剂量。 4.PBX1减少UVB照射引起的PIG1细胞黑色素及ROS生成 过表达PBX1后进行90mJ/cm2的UVB照射处理： （1）UVB照射组的黑色素含量明显增加，酪氨酸酶活性升高，黑色素生成相关蛋白的表达升高，同时ROS生成增多。 （2）各组UVB照射后，过表达PBX1组相较于Control组及Vector组黑色素含量减少，酪氨酸酶活性降低，黑色素生成相关蛋白表达减少，同时ROS生成减少。 （3）检测到UVB照射可引起DNA损伤增加，DNA损伤修复相关蛋白表达升高，过表达PBX1能够降低由UVB照射引起的相关指标升高。 结论： 1.过表达PBX1可促进PIG1细胞增殖、迁移，并降低PIG1细胞凋亡。 2.UVB照射可导致PIG1细胞黑色素生成增加，并导致ROS累积，伴随DNA损伤增加。 3.过表达PBX1能够减少黑色素生成，并降低由UVB照射所致的黑色素生成增多、ROS累积及DNA损伤。
NETL