摘要
黑曲霉是柠檬酸生产的重要细胞工厂。数学模型显示，黑曲霉发酵合成柠檬酸的过程中存在三个限速步骤：①黑曲霉摄取胞外葡萄糖进入胞内；②柠檬酸由线粒体转运至胞质；③柠檬酸由胞质转运至胞外。其中对葡萄糖转运蛋白和细胞膜上的柠檬酸转运蛋白已经有过详细的研究，但位于线粒体上的柠檬酸线粒体载体(Ctps)尚未完全确定，阻碍了高产柠檬酸黑曲霉菌株的构建。本论文以酿酒酵母线粒体柠檬酸转运体ScCtp1为模板搜寻黑曲霉基因组中的直系同源基因，发现六个假定的ctp编码基因(ctp1-ctp6)。RT-PCR检测结果显示，6个基因均有转录，但其中ctp1仅在发酵后期才检测到转录。为了研究者六个假定ctps在柠檬酸转运和胞外积累中的作用，构建了ctp1-6单基因和多基因缺失突变体，发酵分析发现敲除导致了不同发酵阶段柠檬酸积累程度的下降，而突变体S1696（Δctp1-6）丧失了柠檬酸的积累能力。此外，S1696还表现出生长迟缓、分生孢子形成减少和色素形成减少的缺陷。菌落形态分析表明，外源柠檬酸盐能部分恢复分生孢子的形成和色素形成。在同一amyA位点上将每个ctp分别重新引入到S1696中，发现ctp1、ctp2和ctp4分别恢复了亲本菌株88.5%、93.8%和94.6%的柠檬酸积累程度。此外，再引入ctp1、ctp2或ctp4也可以部分恢复分生孢子的形成和色素的产生。在亲本菌株中单独过表达ctp1、ctp2和ctp4可使柠檬酸积累量分别显著增加32.8%、19.3%和24.2%。上述结果表明，多个Ctp以协同的方式参与了柠檬酸跨线粒体膜的转运，增强这一过程可以促进黑曲霉柠檬酸的积累。
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