摘要
食源性病原体引起的食源性疾病是威胁人类健康和安全的主要问题之一，其中副溶血性弧菌和沙门氏菌又是引发肠道感染的常见病原体。因此开发一种快速、简单、灵敏的检测方法及了解致病菌的遗传分布等特点对监视和控制食源性致病菌具有重要意义。本课题依托等温扩增的灵敏性、特异性、反应时间短等特点，对副溶血性弧菌进行特异性可视化检测；同时利用全基因组测序对副溶血性弧菌和沙门氏菌进行基因分型同时寻求一种更为适合亲缘关系相近菌株的分型方法，最终了解菌株之间的遗传关系。 （1）副溶血性弧菌可视化检测方法的建立。以适配体特异性识别副溶血性弧菌为基础，利用链置换等温扩增方法，结合金纳米粒子的特性，建立副溶血性弧菌可视化检测方法。以适配体作为识别单元（Apt-T），特异性识别副溶血性弧菌以后解链释放互补链T，T作为目标序列进一步诱导SDA扩增反应，产生大量的单链DNA，金纳米粒子静电吸附单链DNA并保护其在NaCl的作用下不发生聚集，溶液呈红色，相反溶液则呈现蓝色。基于此，根据体系溶液颜色的变化可以对副溶血性弧菌进行可视化检测，同时利用金纳米粒子的紫外特征吸收峰的改变可以对其进行定量检测。结果表明，该方法检测限为20CFU/mL；具有良好的特异性，对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、阪崎克罗诺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等常见的食源性致病菌无交叉反应。本研究表明所构建的该体系可用于虾中副溶血性弧菌的快速识别。 （2）副溶血性弧菌、沙门氏菌分型方法的建立。对副溶血性弧菌进行多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）、核心基因组多位点序列分型（coregenomemultilocussequencetyping,cgMLST）、耐药基因分型和毒力因子分型，表明106株副溶血性弧菌属于45个ST型，55株未知ST型，比例超过50%，具有遗传多样性，分析其主要原因为地域的差异。cgMLST分型方法显示出高分辨率和高等位基因差异，本课题使用的耐药基因和毒力因子分型方法推断出的共同假定祖先与cgMLST方法相同并且大部分菌株的分型结果与cgMLST方法一致，且在一些菌群中聚类结果相同，显示出较高的分辨率，且分型效果优于MLST方法。 对沙门氏菌进行血清型鉴定、脉冲场凝胶电泳分型（Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）、cgMLST分型和功能基因分型，106株沙门氏菌根据全基因组数据预测出8种血清型和8种ST型，且数量最多的血清型是肠炎沙门氏菌血清型，均属于ST11；由于分离地点和时间接近，PFGE结果显示菌株被切分分为11到18个DNA片段，被聚类为7个集群，菌株相似性超过89%，显示出高度的遗传相似性；cgMLST分型方法对亲缘关系相近的菌株分型仍表现出较高的分辨率，可以将沙门氏菌分为7个集群，等位基因差异在0~2257之间；功能基因分型将亲缘关系最近的91株肠炎沙门氏菌分为9个集群，与cgMLST方法集群比较，聚类准确率超过82%，虽然根据59个基因分析的进化关系准确性低于基于2466个核心基因的cgMLST方法，但它能够通过使用比cgMLST方法更少的基因更快速的来区分每个菌株，适用于亲缘关系较近的沙门氏菌的聚类和分型。
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