摘要
己酸乙酯是一种具有强烈水果风味的酯类化合物，天然存在于苹果、梨、菠萝、葡萄、草莓等水果中。它被广泛应用于食品化工行业，用来生产各类食用香料、烟草香精、有机合成中间体等。己酸乙酯在白酒行业中也有着重要的应用，是浓香型白酒最重要的风味成分，其含量的多少直接决定白酒的品质。选育适量高产己酸乙酯的酿酒酵母菌株，对于提高白酒产品质量具有重要意义。本研究主要将己酰辅酶A生物合成途径以及来源于水果的醇酰基转移酶基因同时引入酿酒酵母AY14α构建产己酸乙酯菌株，通过代谢工程策略优化己酸乙酯合成途径，从而选育出高产己酸乙酯的酿酒酵母菌株。主要研究内容及结论如下： （1）产己酸乙酯菌株的构建 本文首先尝试在酿酒酵母AY14α中构建单质粒CRISPR-Cas9基因编辑系统，通过中断菌株AY14α的CAN1和ADE2基因验证系统的可用性，基因中断效率分别达到98%和91%。利用单质粒CRISPR-Cas9系统对AY14α进行单位点基因编辑，在AY14α基因组的10个不同位点引入报告基因yEGFP，比较外源基因在各个位点的基因表达强度，为己酸乙酯合成途径基因整合位点的选择提供参考。为了后续更加高效的引入外源基因，进一步在AY14α基因组的2个不同位点同时引入报告基因yEGFP，探究利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在双位点同时整合外源基因的效果。 为了构建产己酸乙酯菌株，将来自瘤胃菌CPB6的RbHbd基因（编码3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶）和RbCrt基因（编码3-羟基丁酰辅酶A脱水酶）、来自齿垢密螺旋体的TdTer基因（编码反式烯酰辅酶A还原酶）、来自富养罗尔斯通氏菌的BktB基因（编码β-酮硫解酶）和来自草莓的SAAT基因（编码醇酰基转移酶）引入出发菌株AY14α基因组的YCR011C、YBR128C、308a、416d和YHR142W位点，成功构建获得产己酸乙酯工程菌株Rb-HCSTB。经玉米浓醪发酵，工程菌株Rb-HCSTB的己酸乙酯产量达到8.76±1.53mg/L。 （2）己酸乙酯生物合成途径基因的探究 为了考察不同来源的己酸乙酯代谢途径基因对己酸乙酯合成的影响，选取7对不同来源的Hbd和Crt基因（来源于具有产己酸能力梭菌）、5种不同来源的Ter基因（来源于眼虫及4株梭菌）、3种不同来源的Thl基因（来源于克氏梭菌）和5种不同来源的AAT基因（来源于水果）引入AY14α，构建产己酸乙酯菌株。结果显示，在AY14α中，不同来源基因所编码的蛋白具有一定的底物偏好性。来源于克氏梭菌的CkHbd和CkCrt基因所编码的蛋白更有利于己酸乙酯的生物合成。来源于拜氏梭菌的CbeTer基因所编码的蛋白可以将大量的巴豆酰辅酶A转化为丁酰辅酶A，能够显著提高菌株的己酸乙酯产量。来源于富养罗尔斯通氏菌的BktB基因所编码的蛋白能够有效催化丁酰辅酶A转化为3-酮己酰辅酶A，有助于己酸乙酯的生物合成。来源于森林草莓的VAAT基因所编码的蛋白更偏向于催化合成短中链脂肪酸乙酯，能够显著提高菌株的己酸乙酯和辛酸乙酯产量。 （3）己酸乙酯生物合成途径的优化 为了进一步提高己酸乙酯的产量，将最有利于己酸乙酯合成的外源基因引入AY14α，构建获得共表达CkHbd、CkCrt、CbeTer、BktB和VAAT基因的工程菌株Ck-HCVB-CbeTer。经玉米浓醪发酵，菌株Ck-HCVB-CbeTer的己酸乙酯产量达到30.99±1.15mg/L，约为菌株Rb-HCSTB的3.5倍。该结果说明优选基因的组合表达能够显著提升工程菌株的己酸乙酯合成能力。 为了增加己酸乙酯的代谢通量，在Ck-HCVB-CbeTer的基础上双拷贝表达CbeTer或/和BktB基因。菌株Ck-HCVB-2CbeTer的己酸乙酯产量达到42.35±1.75mg/L，与Ck-HCVB-CbeTer相比己酸乙酯产量进一步提高36.66%，该结果说明CbeTer基因的双拷贝表达可以有效提高己酸乙酯的产量；菌株Ck-HCV2B-CbeTer的己酸乙酯产量达到27.65±0.70mg/L，与Ck-HCVB-CbeTer相比己酸乙酯产量降低10.78%，该结果说明BktB基因的双拷贝表达可能不利于己酸乙酯的合成。为了增加前体物质乙酰乙酰辅酶A的产量，在菌株Ck-HCVB-CbeTer、Ck-HCVB-2CbeTer、Ck-HCV2B-CbeTer和Ck-HCV2B-2CbeTer中过表达酵母自身的Erg10基因。结果显示，大部分工程菌株的己酸乙酯产量均有一定程度降低，表明在本研究所构建的工程菌株中Erg10基因的过表达不利于己酸乙酯的合成。
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