摘要
背景和目的： 恶性肿瘤的发病率和死亡率居高不下，已成为全球性经济和医疗的沉重负担,其目前尚缺乏非常特异的诊断及病情进展标志物。有研究证明在肿瘤微环境中，中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellulartraps，NETs）可以促进恶性肿瘤的相关血栓形成、侵袭转移以及炎症反应，组织中浸润的NETs含量与外周血中的NETs水平相关，但目前外周血中的NETs水平与恶性肿瘤之间的关系尚缺乏深入研究的临床资料。 方法： 细胞实验：用佛波酯（phorbolmyristateacetate，PMA）、胶质瘤细胞LN18的条件培养基分别与中性粒细胞在体外共培养，荧光和免疫荧光检测NETs的释放情况。临床研究：收集263例恶性肿瘤患者（胶质瘤55例、卵巢癌101例、结直肠癌64例和肺癌43例）和75例健康对照，使用ELISA、荧光核酸染色定量法检测研究对象血清中NETs标志物瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinatedhistoneH3，citH3）和细胞游离DNA（cellfreeDNA，cfDNA）的水平。另外使用实验室Sysmex-XN2000全自动血细胞分析仪检测研究对象全血中全身炎症相关参数的水平，包括中性粒细胞（neutrophils，Ne），淋巴细胞（lymphocytes，Ly），单核细胞（monocytes，M），血小板（platelets，PLT），并计算中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyteratio，NLR），单核细胞/淋巴细胞比值（monocyte-to-lymphocyteratio，MLR），血小板/淋巴细胞比值（platelet-to-lymphocyteratio，PLR），全身免疫炎症指数（systemicimmuneinflammationindex,SⅡ），全身炎症反应指数（systemicinflammationresponseindex，SIRI）的水平。评估恶性肿瘤患者外周血中的citH3和cfDNA水平在恶性肿瘤的诊断，合并静脉血栓栓塞（venousthromboembolism，VTE）发生，临床分期以及全身炎症反应中的应用价值。 结果： 1.PMA在体外刺激中性粒细胞1-4h，荧光染色及定量结果显示PMA刺激中性粒细胞释放NETs的面积随着时间增加显著高于对照（P＜0.01或P＜0.001）；免疫荧光共染citH3和DNA进一步证实了NETs的生成。胶质瘤细胞LN18的条件培养基与中性粒细胞在体外共培养4h，荧光染色及定量结果显示条件培养基刺激中性粒细胞释放NETs的面积明显高于对照（P＜0.0001）；免疫荧光共染citH3和DNA进一步证实了NETs的生成。 2.将肿瘤患者分为肿瘤组及各类型肿瘤组（即胶质瘤、卵巢癌、结直肠癌、肺癌组），肿瘤组和各类型肿瘤组患者外周血中的citH3、cfDNA水平均高于对照组（P＜0.0001）。 3.ROC分析citH3、cfDNA和citH3+cfDNA在肿瘤组及各类型肿瘤组中的曲线下面积（AUC）和约登指数均依次增加。 4.根据肿瘤患者在临床干预后短期内是否合并VTE将其分为未合并VTE组及合并VTE组，两组患者之间的临床干预前citH3和cfDNA水平比较无统计学意义。 5.将肿瘤组和各类型肿瘤组患者均按照临床分期进行分组，在肿瘤组中，晚期（Ⅲ-Ⅳ期）肿瘤患者的citH3和cfDNA水平高于早期（Ⅰ-Ⅱ）患者（P＜0.0001）；在各类型肿瘤组中，除了肺癌组的citH3外，其他类型肿瘤组患者的citH3、cfDNA水平均是晚期患者高于早期患者（P＜0.05或P＜0.01）。即肿瘤患者外周血citH3、cfDNA的水平随着临床分期的增加而升高。 6.通过Spearman非参数分析肿瘤组和各类型肿瘤组中的外周血citH3、cfDNA水平与全身炎症相关参数之间的相关性。cfDNA在肿瘤组、两种及两种以上类型肿瘤患者中与Ne、M、MLR、SIRI呈正相关（P＜0.05或P＜0.01），在两种及两种以上类型肿瘤患者中与NLR、SⅡ呈正相关（P＜0.05或P＜0.01），与Ly呈负相关（P＜0.05）。即肿瘤患者外周血中的cfDNA水平与Ne、M、NLR、MLR、SⅡ、SIRI呈正相关，与Ly呈负相关。 将肿瘤组和各类型肿瘤组患者均按照临床分期进行分组，cfDNA在晚期肿瘤组、两种及两种以上类型晚期肿瘤患者中与M、MLR、SIRI呈正相关（P＜0.05或P＜0.01），在两种及两种以上类型晚期肿瘤患者中与Ne、NLR、SⅡ呈正相关（P＜0.05或P＜0.01）。即cfDNA与Ne、M、NLR、MLR、SⅡ、SIRI之间的相关性在晚期肿瘤患者中更为显著。 比较肿瘤组和各类型肿瘤组中不同分期患者的全身炎症相关参数水平，NLR、MLR、SⅡ、SIRI在肿瘤组、两种类型肿瘤组患者中随临床分期增加而升高（P＜0.05或P＜0.01），PLR在两种类型肿瘤组患者中随临床分期增加而升高（P＜0.05或P＜0.01）。即肿瘤患者全身炎症相关参数NLR、MLR、PLR、SⅡ、SIRI的水平随着临床分期的增加而升高。 结论： 外周血中的NETs水平可以明确区分健康对照与恶性肿瘤患者，NETs可能通过与循环炎症细胞相互作用参与肿瘤诱导的全身炎症反应，从而促进肿瘤进展，NETs可作为恶性肿瘤诊断及进展的标志物。
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