摘要
猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染猪引起的一种重要的细菌性传染病。多杀性巴氏杆菌是巴氏杆菌科巴氏杆菌属的革兰氏阴性兼性厌氧菌，在我国猪群中，曾以B型和A型为主，D型少见。但是近年来的研究发现A型和D型为主要流行血清型，而B型罕见。我国对于猪巴氏杆菌病的防控技术相对滞后，主要使用的仍是20世纪中期研制的传统疫苗，猪巴氏杆菌病灭活疫苗（B型C44-1株）和猪巴氏杆菌病活疫苗（B型EO630株）等，传统疫苗菌株血清型与当前流行血清型不符，我们最新的研究表明其不能提供针对A型和D型菌株的有效交叉保护。因此，研发针对我国当前流行A型和D型的多杀性巴氏杆菌二价灭活疫苗对于当前猪巴氏杆菌病的防控具有重要意义。本研究以前期筛选的13株A型（A1–A13）和13株D型（D1–D13）多杀性巴氏杆菌为研究对象，对其基本生物学特性、毒力和感染模型及免疫原性等进行系统研究，筛选获得疫苗菌株并制备了猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株），对疫苗的安全性和保护效力进行了客观评价，为猪巴氏杆菌病灭活疫苗的研究与开发奠定基础。具体研究内容如下： 1.猪源多杀性巴氏杆菌候选疫苗菌株的基本生物学特性 对前期筛选的13株A型（A1–A13）和13株D型（D1–D13）候选菌株的培养特性、生长曲线、耐药性和小鼠毒力特性等进行了系统研究。生长曲线测定结果显示，26个菌株生长曲线均具有明显的对数生长期和稳定期，达到活菌含量峰值的时间介于8–12h，细菌活菌含量峰值介于1.3×109–5.8×109CFU/mL。19种抗菌药物的敏感性试验结果显示，26个菌株均对环丙沙星、氟苯尼考和头孢他啶等8种药物高度敏感，对林可霉素均完全耐药。多重耐药性在荚膜D型菌株中占主导地位。小鼠毒力试验结果显示，腹腔注射途径较皮下注射途径对小鼠致病性更强。13株A型菌株的LD50介于7–238CFU，D型菌株LD50介于4.0×104–9.7×105CFU，表明A型菌株的毒力普遍高于D型菌株。本研究为猪源多杀性巴氏杆菌疫苗菌株的筛选和后期大生产中抗原的高密度发酵培养提供了基本试验数据。 2.多杀性巴氏杆菌候选疫苗菌株的免疫原性 以多杀性巴氏杆菌A型A1–A13株和D型D1–D13株为抗原，分别制备氢氧化铝胶佐剂单价灭活疫苗并进行小鼠免疫保护试验。结果显示所有A:L6基因型菌株均不能提供有效的同源保护，但是部分菌株（2/13）却能提供针对A:L3型的异源保护；所有A:L3型菌株均能产生同源保护作用，保护率介于50%–100%，但均不能提供针对A:L6型菌株的异源保护；所有D型菌株均可提供同源保护，保护率介于60%–100%，且几乎所有D型菌株之间均具有交叉保护作用。 根据26个菌株的生长特性、毒力特性、小鼠免疫原性，确定A型强毒株A5、A7和D型强毒株D5、D8作为实验菌株进行仔猪皮下途径与静脉途径攻毒的比较试验，结果显示在同等攻毒菌量情况下，多杀性巴氏杆菌皮下和耳缘静脉接种均能引起典型的巴氏杆菌病临床症状和病理变化，但静脉注射方式产生更严重的临床表现；且A7株对仔猪致病性强于A5株；D8株对仔猪致病性强于D5株。进一步以耳缘静脉注射方式系统测定强毒株A型A7株和D型D8株对仔猪的致病特性，结果显示多杀性巴氏杆菌A型菌株A7对8–9周龄仔猪的致死剂量是2.1×107CFU，D型菌株D8对仔猪致死剂量是5.6×109CFU，且仔猪发病程度与其攻毒剂量具有依赖关系。该研究结果表明A型A7株和D型D8株感染模型构建成功。 多杀性巴氏杆菌A7株和D8株单价灭活疫苗（灭活前抗原含量均为6.0×109CFU/mL）的仔猪免疫保护试验结果显示，免疫仔猪后没有出现任何疫苗残留、发病症状和死亡情况。二免14d后分别使用1个致死剂量的亲本菌株进行耳缘静脉攻毒，结果显示，对照组仔猪全部发病、死亡，以严重的纤维素性肺炎为特征，而A7单价苗免疫组8头仔猪没有出现明显发病症状，保护率为100%（8/8）；D8单价苗免疫组8头仔猪仅1头出现轻微发病症状，保护率为87.5%（7/8）。这表明A7株和D8株单价灭活苗的安全性和保护效力良好。 3.猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）的安全性 以多杀性巴氏杆菌A型A7株和D型D8株为抗原制备猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株），对该疫苗进行系统的安全性评估研究，包括仔猪和妊娠母猪的一次单剂量接种、单剂量重复接种、一次超剂量接种的安全性试验，以及小鼠的一次超剂量接种安全性试验。结果显示，猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）接种仔猪和妊娠母猪的精神状态和食欲情况均正常，均没有发生腹泻、呕吐、死亡等临床现象。疫苗接种猪虽出现了暂时的体温升高，但其接种后24h的平均体温升高不超过1℃，且在48h内恢复正常。21d的观察期结束后，疫苗组猪的接种部位均无明显的局部炎症、组织病变和疫苗残留现象。疫苗接种对猪生产性能的影响试验结果显示，与空白对照组相比，猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A型A7株+D型D8株）对靶动物猪的生长发育、增重、饲料报酬均没有显著影响（P＞0.05）。这表明该疫苗对仔猪和妊娠母猪均是安全的。小鼠安全性试验结果显示，猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）对非靶动物小鼠进行一次超剂量接种是安全的。 4.猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）的保护效力 本研究系统测定了猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）对小鼠和仔猪的最小免疫剂量。小鼠免疫保护试验结果显示，针对A型、D型强毒菌株的攻击，该灭活疫苗0.4mL剂量组小鼠全部存活，且没有出现明显的发病症状和病理变化。疫苗的0.2mL剂量组小鼠针对两种不同血清型菌株的攻击，均提供了9/10以上的保护率。疫苗的0.1mL剂量组小鼠的保护率明显下降（6/10和4/10）。因此，该灭活疫苗提供小鼠8/10以上保护率的最小免疫剂量为0.2mL/只。这为该疫苗效力检验中替代动物的免疫保护效力评价提供了参考依据。 仔猪免疫保护试验结果显示，针对A型、D型强毒菌株的攻击，猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗2mL/头的接种剂量均能给予免疫仔猪完全保护。当接种剂量减为1mL/头时，免疫仔猪仍能较好的抵御强毒菌株的攻击。疫苗免疫的仔猪保护率均在80%（4/5）以上。当接种剂量减为0.5mL/头时，免疫仔猪的保护率明显降低，其免疫效力不能提供免疫仔猪足够的保护效力（≤2/5）。因此，该疫苗提供仔猪4/5以上保护的最小免疫剂量为1mL/头，制备的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）针对当前流行的A型和D型菌株均具有较强的免疫保护效力。 综上所述，本研究从13株A型和13株D型多杀性巴氏杆菌菌株中分别筛选出免疫原性强的A型A7强毒株和D型D8强毒株，以其制备的猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）对仔猪和小鼠均具有良好的安全性，且对当前流行的A型和D型菌株均具有较强的免疫保护效力。该研究为后期猪巴氏杆菌病二价灭活疫苗（A7株+D8株）的开发和应用奠定基础。
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