摘要
奶牛乳腺炎是对奶牛业危害最大的疾病之一，不仅造成经济损失，而且也会通过影响乳品质进而危及人类健康。目前抗生素疗法仍然是治疗奶牛乳腺炎的主要手段，但抗生素虽然能够杀死侵入乳腺组织的病原菌，却不能有效的控制炎症反应进程，而过度炎症反应恰恰是造成乳腺组织损伤的重要原因。在炎症过程中释放的促炎因子等可导致铁死亡的发生。而且，发生铁死亡的细胞会产生和释放大量过氧化物等毒性物质，这些又成为促进炎症加剧的因素。目前乳腺炎中是否发生铁死亡及铁死亡对其影响未见报道。谷胱甘肽-S-转移酶A1（Gsta1）是广泛分布于各种生物体内的一组多功能同工酶，已有研究表明Gsta1能作用于谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），而GPX4是铁死亡发生过程中的关键酶。然而，Gsta1在乳腺炎发病过程中是否通过抑制乳腺上皮细胞铁死亡缓解乳腺炎症反应有待研究。因此，本研究通过建立LPS诱导的小鼠乳腺炎模型和LPS刺激诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应模型，从调控铁死亡角度，系统研究了Gsta1、铁死亡与乳腺上皮细胞炎症之间的关系与调控机制。 为了明确铁死亡在LPS诱导的小鼠乳腺炎中的作用，本研究通过腹腔注射铁死亡抑制剂Fer-1随后乳导管灌注LPS构建小鼠乳腺炎模型，收集乳腺组织制作切片进行Hamp;E染色、普鲁士蓝染色和免疫荧光染色等。结果显示，与对照组相比，LPS处理组的小鼠乳腺腺泡内炎性细胞数量增多、铁累积增多和紧密连接蛋白减少，而Fer-1处理显著减轻了乳腺腺泡内的炎性细胞浸润、铁积累、并增加了紧密连接蛋白的表达，表明Fer-1预处理可减轻LPS诱导的乳腺组织损伤。对MPO活性和促炎细胞因子表达的检测结果显示，Fer-1可减少乳腺内促炎介质的产生。这些结果表明，抑制铁死亡可缓解LPS诱导的乳腺组织损伤和炎症反应。 为了探究铁死亡在乳腺炎中的作用与机制，本研究使用LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞发生炎症反应，探究乳腺上皮细胞发生炎症反应时是否伴随铁死亡发生。CCK-8结果表明Fer-1显著抑制LPS诱导的细胞死亡，这表明LPS刺激可以导致小鼠乳腺上皮细胞发生铁死亡。为探究铁死亡对小鼠乳腺上皮细胞中炎症反应的作用，本研究用Fer-1预处理小鼠乳腺上皮细胞2h，随后LPS处理24h。Westernblot结果显示Fer-1可显著抑制LPS导致的iNOS和COX-2的表达量增加，这表明在小鼠乳腺上皮细胞中抑制铁死亡可抑制炎症反应。 以上结果表明在乳腺上皮细胞发生炎症反应时伴随铁死亡的出现，并且抑制铁死亡可抑制炎症反应。随后，本研究通过诱导小鼠乳腺上皮细胞发生铁死亡并进行转录组测序筛选出差异基因。结果显示发生铁死亡时Gsta1转录水平显著升高，这表明Gsta1可能在小鼠乳腺上皮细胞发生铁死亡时起到一定作用。为了揭示Gsta1在乳腺上皮细胞铁死亡中的作用，本研究使用Gsta1的siRNA沉默Gsta1表达后，用铁死亡诱导剂RSL3与Erastin诱导小鼠乳腺上皮细胞铁死亡，CCK-8结果显示敲低Gsta1可提高细胞的铁死亡抗性。此外，敲低Gsta1可降低RSL3诱导的细胞MDA、ROS和铁离子浓度增加。这些结果表明，在小鼠乳腺上皮细胞中敲低Gsta1可在一定程度上抑制小鼠乳腺上皮细胞发生铁死亡。 综上所述，在小鼠发生乳腺炎的过程中伴随铁死亡的出现，并且抑制铁死亡可缓解乳腺炎小鼠的乳腺组织损伤。体外结果表明抑制Gsta1可在一定程度上抑制小鼠乳腺上皮细胞发生铁死亡。因此，靶向Gsta1来抑制乳腺上皮细胞铁死亡的发生有望成为治疗乳腺炎的有效方式。
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