摘要
目的:揭示食管鳞癌细胞中TDP-43的表达及其调控的分子作用机制，提供TDP-43作为食管鳞癌的诊断标志物和临床治疗靶标的潜力。 方法:（1）通过整合分析TCGA和GEO数据库，探索食管鳞癌患者肿瘤组织与正常食管组织中TDP-43差异表达，构建慢病毒载体，获得稳定沉默或过表达TDP-43的食管鳞癌细胞系，进行体内和体外实验确定TDP-43对食管鳞癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力的影响。（2）在食管鳞癌稳定沉默TDP-43后通过RNA-seq鉴定在转录水平受TDP-43调控的基因，在野生型食管鳞癌细胞中通过ChIP-seq鉴定TDP-43结合的DNA片段，同样在野生型食管鳞癌细胞中通过RIP-seq鉴定TDP-43结合的RNA,联合分析三种测序数据筛选下游候选基因，并在TCGA和GEO数据库中分析这些基因在食管鳞癌患者肿瘤组织与正常食管组织中表达水平，筛选出下游差异基因TP63。（3）通过RT-qPCR和Westernblot检测食管鳞癌细胞系中TP63水平是否受TDP-43表达水平影响。（4）通过双荧光素酶报告基因实验验证TDP-43在TP63启动子结合区域的结合基序，再经ChIP-qPCR验证TDP-43和TP63基因启动子区域结合的富集水平。（5）通过RIP-qPCR验证食管鳞癌中TDP-43与TP63的直接结合,并对TDP-43的RNA结合结构域进行截断,构建截断体质粒,经RIP-qPCR检测不同的截断体与TP63结合的富集水平变化。（6）经放线菌素D实验探究TDP-43是否影响TP63的mRNA稳定性，再经co-IP实验联合蛋白质谱分析，鉴定食管鳞癌细胞内与TDP-43结合的蛋白，并分析相互结合蛋白中已知的影响mRNA稳定的目标蛋白，通过RIP实验验证细胞中影响稳定性的蛋白PABPC1和HuR与TP63相互作用，经免疫荧光实验确定TDP-43和互作蛋白在食管鳞癌细胞中定位情况。（7）通过JASPAR和hTFtarget预测网站分析预测，并在TCGA数据中分析这些转录因子在食管鳞癌肿瘤组织与正常组织的表达差异，筛选出在食管鳞癌肿瘤组织中高表达的上游转录因子。之后通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP-qPCR验证TP63在TDP-43基因启动子区域结合的情况。 结果:（1）通过对TCGA和GEO中数据分析，我们发现TDP-43在食管鳞癌组织中高表达。首先，我们在食管鳞癌细胞中稳定沉默TDP-43,通过细胞增殖计数和克隆形成实验发现其能显著抑制细胞增殖，而过表达TDP-43结果相反。裸鼠皮下瘤实验进一步验证TDP-43能够促进食管鳞癌恶性发展。（2）通过对RNA-seq,ChIP-seq,RIP-seq和TCGA数据联合分析共同鉴定到候选下游差异基因TP63。（3）TP63在食管鳞癌组织中高表达，敲低TDP-43,TP63转录水平和蛋白显著下调;过表达结果相反。（4）双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR实验表明TDP-43可结合在TP63基因启动子区域。（5）RIP实验表明TDP-43通过两个RNA结合结构域与TP63结合。（6）放线菌素D实验表明TDP-43能够影响TP63的mRNA稳定性,co-IP实验鉴定出PABPC1和HuR这两个RBP能够分别与TDP-43相互作用从而稳定TP63的mRNA表达。免疫荧光实验表明他们在食管鳞癌细胞中分别与TDP-43共定位。（7）JASPAR和hTFtarget预测以及TCGA数据筛选出上游转录因子TP63,利用ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验发现TP63可结合在TDP-43基因启动子区域。 结论:（1）TDP-43在食管鳞癌中高表达，促进食管鳞癌的恶性进展。（2）TDP-43能够结合在TP63的启动子区域，作为转录因子调控TP63的表达。（3）TDP-43通过RRM1和RRM2这两个结合结构域与TP63结合，与PABPC1和HuR分别相互作用促进TP63的mRNA稳定性。（4）TP63是TDP-43的上游转录因子,调控TDP-43转录水平表达。
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