摘要
金银花(Lonicerajaponica)是藤本植物忍冬干燥的花蕾或初生的花。在中国，金银花自古以来就因其广泛的药用价值而闻名，其功效主要是清热解毒、抗菌消炎等。MicroRNAs(miRNAs)作为一类非编码小RNA,在植物的生长发育中发挥重要的作用。目前，已有研究从基因组、代谢组、转录组、蛋白质组层面对金银花进行充分报道，然而关于金银花发育过程中的转录后修饰以及miRNA的调控功能研究却鲜有报道。本研究通过对金银花幼蕾期、三青期、大白期、银花期、金花期五个时期的miRNA测序以及结合转录组和代谢组研究，分析和鉴定了金银花不同花期中的miRNAs及其靶基因，并对miRNA及靶基因的调控功能进行预测。 具体实验分析结果如下: (1)MiRNA与靶基因鉴定:在幼蕾期、三青期、大白期、银花期、金花期分别鉴定到了425、426、487、524、489个miRNAs,其中新的miRNAs有44个，有326个miRNAs在五个时期中被共同鉴定。对金银花所有新的miRNAs的成熟长度进行了分析，成熟序列长度分布在21nt、22nt、24nt。对金银花幼蕾期和其它时期表达量有显著差异的234个miRNAs进行靶基因预测，获得2678个靶基因，并联合金银花转录组数据对miRNA及其靶基因的表达模式进行相关性分析，最终获得83个miRNAs以及182个靶基因。 (2)MiRNA对金银花开花时期的调控作用分析:miRNA与靶基因表达模式相关性分析发现Car-miRN777调控的靶基因最多，主要参与RNA、蛋白质、脂质代谢、运输和次生代谢等过程，其中靶基因ELF7和CPK33均参与开花调控，预测Car-miRN777可能通过靶向ELF7/CPK33参与花期转导的调控。靶基因功能聚类发现，miR319家族调控的靶基因MYB33和TCP能够调节花瓣和花药的激素水平，预测miR319家族部分成员在金银花开花过程中可能通过调控MYB33/TCP影响花的发育。利用实时荧光定量PCR对挑选的miRNA及其靶基因在五个时期的表达模式进行分析，实验结果与分析结果一致。 (3)MiRNA对金银花次生代谢调控相关性分析和预测:金银花五个时期的代谢组整合分析发现，Hsy-miR160I的靶基因预苯胺酸脱氢酶(ADT)被映射到到了苯丙烷合成途径中，催化苯丙氨酸生物合成的最后一步。另外Hsy-miR160I与ADT在金银花开花过程中表达逐渐下降，且相关代谢物含量在金银花开花过程中也逐渐下降。说明Hsy-miR160I可能在金银花不同花期通过调节上游的苯丙氨酸通量来控制下游的次生代谢产物的含量。转录因子及其结合位点预测分析显示，Hbr-miR482d可以靶向MYB1,同时在二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)启动子序列中存在MYB1的结合位点。Hbr-miR482d、MYB1、DFR的实时荧光定量PCR以及花青素的含量的测定结果预测表明在金银花开花过程中Hbr-miR482d可能通过调控转录因子MYB1和DFR基因的结合从而诱导花青素的积累。 本研究通过miRNA测序以及整合金银花转录组和代谢组的数据，鉴定并预测了在金银花开花过程中调控花发育及次生代谢特别是花青素类合成的miRNA及其靶标基因，初步揭示了miRNA调控金银花开花过程中次生代谢产物积累的潜在机制;本研究对深入揭示金银花生长发育的调控机制以及提高金银花次生代谢产物的含量研究奠定了一定的基础。
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