摘要
环腺苷酸（cAMP）在生物体的生命活动中起到十分重要的作用。本研究选用工业酿酒酵母作为出发菌株，通过调控环腺苷酸信号通路中腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的活性来探究酿酒酵母胞内cAMP水平的变化，同时研究其耐受性，旨在研究调控环腺苷酸信号通路中的基因对酿酒酵母胞内cAMP水平及耐受性的影响。主要研究内容及结果如下： （1）以酿酒酵母AY12a和AY12α作为出发菌株，KanMX抗性基因为筛选标记基因，利用胞内同源重组方法，分别敲除基因PDE1、PDE2，构建4株单基因敲除菌株A1（AY12a-ΔPDE1）、A2（AY12a-ΔPDE2）和B1（AY12α-ΔPDE1）、B2（AY12α-ΔPDE2）；在出发菌株的Gal80位点使用强启动子PGK1p和终止子PGK1t分别对基因RAS2、GPA2和CYR1进行过表达，构建6株单基因过表达菌株A3（AY12a-RAS2）、A4（AY12a-GPA2）、A5（AY12a-CYR1）和B3（AY12α-RAS2）、B4（AY12α-GPA2）、B5（AY12α-CYR1）。对上述重组菌株进行杂交生孢，通过细胞融合分担的方法构建10株双基因改造菌株A6（AY12a-ΔPDE1-RAS2）、A7（AY12a-ΔPDE2-RAS2）、A8（AY12a-ΔPDE1-GPA2）、A9（AY12a-ΔPDE2-GPA2）、A10（AY12a-ΔPDE1-CYR1）和B6（AY12α-ΔPDE1-RAS2）、B7（AY12α-ΔPDE2-RAS2）、B8（AY12α-ΔPDE1-GPA2）、B9（AY12α-ΔPDE2-GPA2）、B10（AY12α-ΔPDE1-CYR1）。测定菌株的24h生长曲线，发现改造菌株与出发菌株的生长性能没有明显差异。 （2）利用高效液相色谱法对改造菌株进行胞内cAMP水平的测定，实验结果显示，改造菌株A8、A9的胞内cAMP水平相比出发菌株分别增加了1.08倍和0.37倍，改造菌株B8、B9的胞内cAMP水平相比出发菌株分别增加了0.7倍和0.3倍。该结果表明，在敲除基因PDE1的基础上再进行基因GPA2的过表达，会使酿酒酵母胞内cAMP的水平有较为明显的提升。 （3）通过点板实验来测定改造菌株的生长耐受性，将出发菌株与改造菌株置于0.4%乙酸、5%乳酸、10%乙醇和8%NaCl胁迫环境下，观察菌株的生长情况。实验结果显示，菌株A8的乙酸耐受性相比原菌有所提高，菌株A10的乙酸耐受性也有提高，但其耐盐能力下降；其他改造菌株在不同胁迫环境下的生长能力相比原菌表现出不变或降低的趋势。该结果表明，在敲除基因PDE1的基础上再进行基因GPA2或CYR1的过表达，会使酿酒酵母AY12a的乙酸耐受性有所提高。
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