摘要
左旋多巴是治疗帕金森病的最有效的药物之一，随着帕金森病发病率的增加以及左旋多巴新应用的开发，对左旋多巴的需求量也在逐年增加。目前，左旋多巴的生产还主要依赖于化学合成，但存在反应过程复杂和金属催化剂成本较高等问题，而酶催化法由于底物专一性强和催化效率高等优势成为生产左旋多巴的新途径。酪氨酸酶可催化酪氨酸生成左旋多巴，该方法在合成左旋多巴方面有着良好的前景，然而目前大多数天然酪氨酸酶的单酚酶活力较低，且稳定性差，不能用于高效生产左旋多巴。 为提高酪氨酸酶的单酚酶活力，本研究选择Bacillusaryabhattai来源酪氨酸酶（abTYR）进行多位点迭代饱和突变，并筛选高单酚酶活力的突变体。首先，对abTYR进行同源建模和分子对接分析，由于酪氨酸酶含有6个保守的组氨酸残基协同两个铜离子发挥催化活性，因此将铜离子结合位点热点区域作为第一突变区域；分子对接结果表明，酪氨酸进入abTYR底物结合口袋后与多个氨基酸残基存在相互作用，因此选择底物结合位点热点区域作为第二突变区域；在酪氨酸酶催化酪氨酸的过程中常有一个水分子介导底物去质子化，因此选择水分子结合位点热点区域作为第三突变区域。 通过迭代饱和突变策略构建abTYR突变体文库，筛选获得了高单酚酶活力的突变体MT6（G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W），其比活力是WT的4.17倍，Km是WT的3.04倍，Kcat是WT的3.88倍，催化效率（Kcat/Km）是WT的11.79倍。 利用分子动力学模拟进一步分析了abTYR突变前后与底物酪氨酸分子间作用关系。突变后，酪氨酸在abTYR的底物结合位点区域发生了位置的变化，并与abTYR多形成了一组氢键，使之与abTYR之间相互作用更强；另外，氨基酸位点的突变导致突变体MT6比WT拥有更大的底物结合位点空间，更易于酪氨酸与abTYR发生催化作用；突变体MT6比WT拥有更加稳定的结构，增强了abTYR的稳定性。 以酪氨酸为底物，利用突变体MT6进行催化生成左旋多巴，左旋多巴的产率为84%。
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