摘要
破囊壶菌是一类广泛分布于全球海洋、河口栖息地的单细胞异养真核原生生物，因其具有生产多种高附加值活性物质的潜力而备受关注。目前，尽管研究者们不断筛选新菌株并优化发酵工艺，破囊壶菌的DHA（docosahexaenoicacid，C22:6）产量取得了较大的提高，但距工业化生产仍有较大差距。此外，破囊壶菌的DHA合成机理及对碳、氮源等营养或环境因子的具体应答分子机制尚不明晰，这些均是制约破囊壶菌高效发酵生产DHA的因素。 本研究以实验室分离的破囊壶菌Aurantiochytriumsp.PKU#SW8菌株为研究对象，首先，以提高破囊壶菌DHA产量为出发点，建立了破囊壶菌DHA生产潜力株PKU#SW8高效合成DHA的优化发酵工艺；其次，探究了不同氮源及限氮条件对PKU#SW8菌株DHA合成能力的影响，初步揭示了相应的分子应答机制；最后，对pfaB基因进行克隆、异源表达，并通过基因敲低等实验阐明了pfaB基因在DHA生物合成过程中的关键作用。具体研究内容和结果如下： （1）PKU#SW8菌株高效合成DHA的培养条件为温度28℃，pH6.47，海水盐度80.00%，200rpm，甘油20.00g/L，细菌蛋白胨2.50g/L；在此条件下，摇瓶发酵DHA产量较初始提高1.02倍；5L发酵罐获得的最大DHA产量可达2.14g/L，DHA产量较摇瓶发酵提高54.76%，较初始提高1.55倍。 （2）氯化铵，硝酸钠，谷氨酸钠三种不同氮源对PKU#SW8菌株的DHA合成的代谢和分子机制影响差异显著，与无机氮源相比，有机氮源培养条件下糖酵解途径、TCA循环（tricarboxylicacidcycle）以及脂肪酸合成的FAS（Fattyacidsynthesispathway，FAS）和PKS（Polyketidesynthesispathway，PKS）途径等均明显上调，促进了菌株生长和DHA的合成。两种无机氮源之间，铵态氮培养条件下糖酵解途径的上游代谢增强，促进了TAG（triglyceride）的合成；硝态氮培养条件下更有利于脂肪酸合成前体以及TCA循环中能量的产生，从而在一定程度上促进了DHA的合成。 （3）限氮培养条件下，PKU#SW8菌株的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的积累都得到了增加，PKS途径通量得到增强，而FAS途径通量降低；其中，pfaB基因表达上调，与DHA含量增加相对应，说明此条件下PKS途径通量的提高是由于pfaB基因表达的上调所引起，这直接促进了该菌株DHA含量的提高。 （4）pfaB基因在大肠杆菌中异源表达成功，使宿主E.coliBL21生产DPA（Docosapentaenoicacid，C22:5）和DHA；pfaB基因敲低（knockdown）之后，与对照组相比处理组菌株DHA产量降低20.83%，pfaB基因相对表达量降低29.00%，以上均证明了pfaB基因在PKU#SW8菌株DHA的生物合成过程中起到关键作用。 综上所述，本研究建立了PKU#SW8高效生产DHA的优化发酵工艺，为其后续实现工业化发酵生产DHA打下了坚实基础，同时也为后续筛选的菌株DHA最优发酵条件的探索研究提供了参考；阐明了三种不同形式的氮源对PKU#SW8菌株的生长及DHA合成影响，初步揭示了相应的分子应答机制，并首次揭示了PKU#SW8菌株胞内的完整氮代谢途径，为破囊壶菌的氮代谢及氮调控研究提供了理论基础；构建了稳定的、适用于破囊壶菌的基因敲低体系，并通过此体系以及基因克隆、异源表达等实验证明了pfaB基因在破囊壶菌DHA的生物合成过程中的关键作用，为破囊壶菌PUFA合成系统相关的理论及应用研究奠定了基础，同时也为破囊壶菌的代谢机制研究提供了理想的平台技术。
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