摘要
冷杉醇是一种重要的二萜物质，存在于针叶树的油树脂、雪莲果的精油和烟草的腺毛中。它是一种对植物的香气特征具有重要影响的挥发性香味化合物的前体物，在烟叶烘烤过程中，冷杉醇可以分裂为具有独特香味的类琥珀化合物，从而影响烟叶的香气品质。但要想获得高纯度的冷杉醇，人工和经济成本高，因此其应用并不常见。二萜类化合物的研究进展给冷杉醇的生物合成创造了更多的可能性。本文以价格低廉的异戊烯醇为底物，以大肠杆菌Escherichiacoli.BL21(DE3)为底盘，构建冷杉醇合成的工程菌株，主要研究内容如下： （1）大肠杆菌引入冷杉醇合成关键酶的研究 为引入冷杉醇合成关键基因，构建了重组质粒pCTI、pAEIG和pRTC。将重组质粒同时转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)的感受态细胞中，获得工程菌株E.coliLSC01。在37℃、200rpm，添加0.5mmol/LIPTG的发酵条件下（添加IPTG后转为25℃培养），采用双相培养（以肉豆蔻酸异丙酯作为有机相）的方式，确定了工程菌株E.coliLSC01能够发酵合成冷杉醇，证明引入的关键基因能够正常表达，途径构建成功，发酵72h后冷杉醇产量达到29.22±2.22mg/L。 （2）全细胞催化方法的可用性探究 基于底物、产物、以及中间产物的毒性对细胞的影响，采用全细胞催化的方法来生产冷杉醇，采用工程菌株E.coliLSC01，使用全细胞催化的方法，将菌体生长和底物转化阶段分开，在转化72h后，冷杉醇产量达到61.22±1.92mg/L；与摇瓶发酵相比，冷杉醇产量提高了109.5%，证明全细胞催化的方法能有效提高冷杉醇的产量。 （3）冷杉醇合成途径的强化和竞争途径的弱化 为了进一步提高冷杉醇产量，将冷杉醇合成途径进行强化，对竞争途径进行弱化。获得双功能二磷酸法呢基合酶高活性突变体ScERG20(F96C)（强化冷杉醇合成途径）；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除酸性磷酸酶基因aphA和HAD磷酸酶基因yqaB（弱化底物损失）；敲除碱性磷酸酶基因phoA（阻断副产物香叶醇合成）和十一异戊酸二磷酸酶基因ybjG（阻断副产物法呢醇合成），成功构建重组质粒pAEFIG，将重组质粒pCTI、pAEFIG和pRTC转入敲除基因的大肠杆菌中，以及合成冷杉醇的工程菌株中，最终获得工程菌株E.coliamp;nbsp;LSC08、E.coliLSC09、E.coliLSC10，结果表明，在上述合成冷杉醇的菌株中，E.coliLSC09的表达量最高，转化72h后，生产冷杉醇108.99±1.87mg/L。 （4）全细胞催化工艺的优化 为了摸索最适合生产冷杉醇的条件，对不同底物类型、不同底物添加量、不同甘油添加量、不同菌体浓度（全细胞催化剂浓度）进行探究。结果表明，当添加单一底物异戊烯醇（DMAOH），终浓度为1.0g/L，添加甘油终浓度为15g/L，添加菌体终浓度为150g/L，转化24h时，冷杉醇产量达到506.36±15.23mg/L，底物转化率为60.16%。
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