摘要
目的: 近年来，以“外泌体”为主的无细胞替代疗法在免疫、组织稳态、癌症和神经退行性疾病等方面极具治疗潜力。外泌体内含的脂质、核酸、蛋白质等生物活性分子赋予它不同的生物学功能。因此本研究探寻恒牙牙髓干细胞(Dentalpulpstemcells,DPSCs)和乳牙牙髓干细胞(Stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED)旁分泌衍生的外泌体蛋白，对于根尖炎性骨缺损的成骨分化是否有效调节，为临床疾病治疗提供新启示。 方法: 1.收集DPSC和SHEDP4-P7细胞上清液:细胞生长密度达70％或90％左右时,PBS清洗后更换基础培养基，收集24-48小时的培养上清液。通过差速离心和外泌体提取液分离后，透射电子显微镜(Transmissionelectronmicroscope,TEM)观察形态特征，蛋白免疫印迹法(Westernblot,Wb)检测特异性标记蛋白; 2.分离提取的DPSC和SHED来源的外泌体进行蛋白组学分析; 3.双糖链蛋白聚糖(Biglycan,BGN)对炎症性牙周韧带干细胞(IPDLSC)成骨分化的调节作用: (1)IPDLSC和牙周韧带干细胞(PDLSC)的增殖能力通过细胞计数试剂盒(Cellcountingkit-8,CCK-8)测定; (2)IPDLSC和PDLSC的成骨分化能力通过茜素红染色检测并进行半定量分析;同时通过RT-qPCR检测成骨相关因子:Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscriptionfactor2.RUNX2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨成形蛋白4(BoneMorphogeneticProtein4,BMP-4)的基因表达水平; (3)BGN对IPDLSC成骨分化的调节作用，通过蛋白免疫印迹法筛选人重组蛋白BGN的最佳有效浓度及作用时长，检测BMP-4/Smad信号通路的相关蛋白表达水平; (4)1μg/mLDPSC-Exos、10μg/mLDPSC-Exos、1μg/mLSHED-Exos、10μg/mLSHED-Exos与IPDLSC共同培养24h后，检测BGN及BMP-4/Smad信号通路的相关蛋白表达水平; 4.建立根尖炎性骨缺损模型，同时将水凝胶搭载外泌体置于骨缺损处，缝合创口。2周后取材固定，通过显微CT(Microcomputedtomography,Micro-CT)进行三维重建分析牙槽骨骨质情况。然后进行组织学切片，通过HE&Masson染色观察组织形态，免疫组织化学染色观察成骨相关抗体的表达水平。 结果: 1.DPSC-Exos和SHED-Exos是DPSC和SHED旁分泌产生的胞外囊泡，均呈双层膜结构，直径在150nm以内，符合外泌体的形态特征。并且表达CD63、CD81、TSG101等特异性标志蛋白。 2.DPSC-ExosVsSHED-Exos的蛋白质表达存在差异。其中，在SHED-Exos中显著性上调且表达水平较高的蛋白有丙酮酸激酶(PyruvatekinaseM,PKM)、双糖链蛋白聚糖(Biglycan,BGN)、钙网蛋白(Calreticulin)、真核翻译起始因子5A-1(Eukaryotictranslationinitiationfactor5A-1,EIF5A-1)。 3.与PDLSC相比，体外IPDLSC的增殖能力增强，成骨分化能力减弱。体外细胞实验通过人重组蛋白BGN与IPDLSC共培养，证实DPSC-Exos和SHED-Exo内含的BGN蛋白可能通过激活BMP-4/Smad信号通路发挥促进成骨作用。低剂量浓度(1μg/mL)SHED-Exos与高剂量浓度(10μg/mL)DPSC-Exos的作用相当，而高剂量浓度(10μg/mL)SHED-Exos的促进成骨效果更加显著。 4.动物模型构建成功。H-DPSC-Exos和H-SHED-Exos两个分组的骨缺损处形成更多的新生骨组织，BGN和BMP-4在骨缺损处呈阳性表达，证实DPSC-Exos和SHED-Exos有一定的治疗效果。 结论: 本研究结果表明DPSC和SHED来源的外泌体促进根尖炎性骨缺损的成骨修复。其中，SHED-Exos富含的BGN是重要的调节器，可能通过激活BMP-4/Smad信号通路促进成骨修复。
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