摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer''sdisease,AD）是一种致死性的进行性神经退行性疾病，也是当今影响最广、老年人中最为常见的神经退行性疾病。截止至2018年，全球共有5000千万痴呆患者，预估到2050年患者人数将增加到惊人的1.52亿。目前中国约有1000万AD患者，并且AD已经成为我国第5大死亡原因。然而AD的发病原因至今尚未阐明，临床上也缺乏可有效预防或阻断疾病进程的药物。AD的主要病理特征包括细胞外由淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）沉积形成的老年斑、神经元内由过度磷酸化tau蛋白（Hyperphosphorylatedtau,pTau）聚积而成的神经元纤维缠结（Neurofibrillarytangles,NFTs）以及广泛的神经元死亡。其中神经元在各种损伤机制的作用下进行性的发生功能丧失和死亡是导致记忆、认知能力衰退的最主要的原因。然而AD中神经元死亡的机制仍不明确，因此进一步阐明AD中神经元死亡的调控机制对于寻找有效的治疗靶点以及AD的药物研发具有十分重要的意义。 程序性坏死是一种调节性细胞死亡，可以由包括肿瘤坏死因子受体在内的死亡受体激活引起。研究表明，细胞程序性坏死参与了AD的发病进程，AD患者大脑中RIPK1水平上调，MLKL的磷酸化和寡聚化水平也显著增加。此外，RIPK1和MLKL与Braak分期呈正相关，表明神经元中程序性坏死的激活可能与pTau相关。然而到目前为止，诱导AD患者神经元发生程序性坏死的关键因子和相关机制仍未见报道。此外，神经炎症也在AD的病理进展中扮演了重要角色。多项实验证据表明小胶质细胞和星形胶质细胞参与了Aβ和Tau的病理进展，它们的激活和随后释放的促炎症因子可直接导致神经元损伤。同时，程序性坏死被发现参与调控包括AD在内的多种神经退行性疾病的神经炎症，活化的RIPK1也被证实能够促进神经炎症。因此，以上研究结果提示程序性坏死可能是神经退行性疾病中调控神经炎症和细胞死亡的关键事件。然而，程序性坏死在AD进程中介导神经炎症的作用及其潜在机制尚未完全阐明。 为了进一步揭示AD中调控程序性坏死的关键因子，分子机制和相关下游事件，本论文在细胞和动物模型层面深入探究了pTau在神经元程序性坏死中的调控作用和分子机理。首先，在神经元细胞系中通过瞬时转染体系确定pTau能否诱导神经细胞发生程序性坏死，结果表明pTau可以诱导神经细胞死亡，而这种死亡可以被程序性坏死抑制剂Nec-1而不是caspase抑制剂所抑制，流式细胞术分析进一步表明这种死亡形式是坏死，同时pTau可以上调RIPK1-RIPK3-MLKL并促进坏死体的形成，表明pTau可以诱导神经细胞发生程序性坏死。然后，通过转录组测序分析了pTau诱导的程序性坏死过程中基因表达水平的改变，结果显示pTau主要上调了包括细胞-细胞因子相互作用信号在内的多种免疫相关的通络，随后的qPCR、Westernbolt和流式细胞术等技术的验证证实了pTau诱导的程序性坏死伴随着多种炎症因子的高表达和ROS水平的上调，并且上调的炎症因子可以进一步促进小胶质细胞的趋化。接着，利用CRISPR-Cas9敲除技术和相关通路抑制剂分析了介导炎症因子上调的信号通路，结果显示pTau可以激活NF-κB信号通路，而NF-κB信号通路的抑制剂或敲除RIPK1-RIPK3-MLKL可以抑制炎症因子上调，因此这一过程主要由RIPK1-RIPK3-MLKL轴依赖的NF-κB信号通路调控。最后，在TauP301S转基因AD模型鼠中检测了大脑中程序性坏死和神经炎症的发生情况，并探究了程序性坏死抑制剂Nec-1s对AD小鼠的神经元死亡、神经炎症、认知损伤和行为缺陷等病症的治疗效果，结果表明pTau同样可以诱导TauP301S小鼠发生程序性坏死和神经炎症，而Nec-1s的治疗可以抑制程序性坏死的发生、NF-κB信号通路和小胶质细胞的过度激活改善神经炎症从而减轻神经元损伤，并最终改善了AD模型鼠的认知和行为障碍，显著延长了小鼠的生存期。 综上，本研究论文首次证实了pTau在诱导神经元发生程序性坏死中的关键作用，揭示了pTau通过激活RIPK1-RIPK3-MLKL轴和NF-κB信号通路协同诱导程序性坏死和神经炎症进而导致神经元损伤的分子机制，同时也确认了程序性坏死的靶向抑制对pTau诱发的AD模型鼠神经元死亡和认知障碍的治疗效果。该研究不仅对理解AD患者中神经元变性的分子机制具有理论意义，对AD的临床诊断和药物研发也具有重要指导意义。
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