摘要
脂滴是细胞内脂质和能量平衡方面的主要细胞器，其功能失调会导致各种疾病。光学成像技术的发展有力促进了人们对脂滴生理功能的研究。然而，脂滴在生物体系中的具体作用机制仍然不明确。为了更加深入地研究脂滴，先进显微成像技术与性能优异的脂滴荧光探针不可或缺。然而，传统的脂滴荧光探针存在一些明显的缺点，例如染色信噪比低、光学稳定性弱以及因为发生聚集诱导荧光淬灭（AggregationCausedQuenching,ACQ）而难以在生物体内追踪脂滴等。这些缺点使得传统荧光探针无法满足先进显微成像技术对荧光探针的苛刻要求。为了解决这一问题，研究者需要研制出各种类型的、适用于先进的显微成像技术的新型脂滴荧光探针，例如适用于受激发射损耗（StimulatedEmissionDepletion,STED）超分辨成像技术的探针与适用于结构光照明显微成像技术（StructureIlluminationMicroscopy,SIM）的探针。本论文旨在通过合理的分子设计，开发出能够克服传统脂滴荧光探针缺点的新型荧光探针，并利用先进荧光成像技术观察脂滴的动态过程，为进一步研究脂滴的不同生理功能提供成像基础。本论文的具体研究内容如下： （1）为了解决传统荧光探针染色信噪比低的问题，开发了一种基于砜基桥联均二苯乙烯骨架的脂滴荧光探针Lipi-Cz-2。通过对比Lipi-Cz-2与其同分异构体Lipi-Cz-1在光物理性质方面的差异，推测出Lipi-Cz-2具有扭曲的分子内电荷转移（TwistedIntramolecularChargeTransfer，TICT）性质，而Lipi-Cz-1具有分子内电荷转移（IntramolecularChargeTransfer，ICT）性质。此外，通过对比Lipi-Cz-2与Lipi-Cz-1在脂滴染色信噪比方面的差别，得出脂滴染色信噪比的提升主要是由TICT态的形成引起的。Lipi-Cz-2还表现出了较好的光学稳定性与细胞相容性，这对于STED超分辨成像非常有利。将Lipi-Cz-2用于STED超分辨成像，可以将脂滴超分辨成像的分辨率提升至65nm。接下来，通过3DSTED超分辨成像成功在纳米尺度上对细胞内的脂滴分布进行了观察。该工作通过合理的分子设计促进了TICT态的形成，为提升脂滴探针的染色信噪比提供了新思路。 （2）为了解决传统脂滴荧光探针光学稳定性较弱的问题，开发了一种基于砜基桥联均二苯乙烯骨架的脂滴荧光探针Lipi-DeepRed。该探针通过引入对氰基苯基基团来保护砜基桥联均二苯乙烯的反应活性位点，以及使用二苯胺给体替代二乙胺给体，显著地提升了光学稳定性。将Lipi-DeepRed用于SIM超分辨成像，成功将分辨率提升至98nm，远高于宽场显微镜的分辨率（358nm）。更重要的是，Lipi-DeepRed优异的光学稳定性使其成功在SIM超分辨成像模式下观察到了纳米尺度小个脂滴的融合过程。利用延时SIM超分辨成像，观察到了脂滴融合的快速过程，该过程所需的时间仅为0.25秒。最后，使用双色SIM超分辨成像，观察到了脂滴与线粒体的两种接触模式，为最近文献报道的两种脂滴与线粒体的接触模式提供了成像上的支持。 （3）为了更好地对生物体内的脂滴进行追踪，研究者们通常采用纳米沉淀法将脂滴荧光探针制备成纳米晶体。不幸的是，传统的脂滴荧光探针在制备纳米晶体时通常会发生ACQ，导致纳米晶体的荧光强度显著降低，这非常不利于生物体内脂滴的追踪。为了解决脂滴荧光探针的聚集诱导淬灭问题，开发了一种基于均二苯乙烯骨架高效深红/近红外固态发光的分子4。通过在均二苯乙烯骨架中引入吸电子的苯乙腈基团与给电子的二苯基胺基基团，得到具有高度扭曲构型的荧光分子，再通过简单的改变末端烷基链触发苯乙腈基团的旋转，并进一步导致二苯基胺基的旋转。这些旋转显著改变明显改变了荧光分子的分子构型，从而影响荧光分子的激发态性质与发射特性。值得注意的是，分子4的荧光量子效率在相似波长深红/近红外发光的有机固体中达到了最高水平。鉴于分子4优异的固态发光性质，利用纳米沉淀法将分子4制备成了纳米晶体，并进一步验证了分子4纳米晶体低的细胞毒性与高的脂滴染色选择性。 综上所述，本论文基于均二苯乙烯骨架开发了三种新型脂滴荧光探针，为传统脂滴荧光探针面临的染色信噪比低、光学稳定性弱以及因为发生聚集诱导淬灭（ACQ）而难以用于生物体内脂滴追踪的问题提供了解决办法。不仅实现了在纳米尺度上观察脂滴动态过程、以及脂滴与线粒体的相互作用，还为在生物体内追踪脂滴提供了一种可能的探针。三种新型脂滴荧光探针的研制为开发新型脂滴探针提供了新的设计策略，有利于更深层次的脂滴生物学研究。
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