摘要
背景与目的: 缺血再灌注损伤已经被证实主要是由过度氧化应激造成的,是移植术后皮瓣坏死的主要原因之一。最近的研究表明琥珀酸脱氢酶(SDH)在缺血过程催化生成堆积的琥珀酸是再灌注期间驱动活性氧生成,导致缺血再灌注损伤的重要原因。有关研究目前仅在心脏、大脑、肾脏中展开。本实验探究了外周皮肤组织缺血再灌注过程中琥珀酸的代谢规律和靶向琥珀酸治疗游离皮瓣缺血再灌注损伤的可行性。结合前沿生物材料设计了一种序贯释放丙二酸二甲酯(DMM,SDH的竞争性抑制剂)和抗氧化应激碳点(RCDs)的微针(DMM/RCDs@MN,命名为DCM),观察DCM对大鼠缺血再灌注皮瓣存活情况的影响。并建立了缺血再灌注损伤的体外模型,从氧化应激的角度探讨药物可能的作用机制。 方法: 本实验共三个部分: (一)皮瓣缺血再灌注过程中琥珀酸代谢的变化规律及丙二酸二甲酯对其代谢量的影响的探究。本研究选取Sprague-Dawley(SD)大鼠腹壁浅血管皮瓣缺血再灌注模型,用显微动脉夹夹毕血管蒂一段时候后再取下血管夹以模拟游离皮瓣的缺血再灌注过程。将大鼠随机分为单纯缺血再灌注组和丙二酸二甲酯提前处理组,分别在四个时间点(缺血前,缺血后8h,再灌注后5分钟,再灌注后30分钟)切取皮瓣检测琥珀酸含量(n=3/每个时间点)。 (二)丙二酸二甲酯和抗氧化应激碳点对抗氧糖剥夺/复氧损伤作用的体外研究。培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),使用缺氧袋(anaerobicbag)建立细胞氧糖剥夺/再灌注模型。分为以下五组:对照组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R组)、OGD/R+DMM组、OGD/R+RCDs组、OGD/R+DMM+RCDs组。使用CCK-8实验选取最佳缺氧/复氧时间和最佳药物浓度。检测再灌注后各组丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性,并进行活性氧荧光染色和线粒体膜电位检测。 (三)双载药微针(DCM)的制备和表征以及DCM对大鼠腹壁缺血再灌注损伤皮瓣存活情况的影响。将15只雄性SD大鼠随机分为5组,每组3只。分组如下:假手术组(Sham组),缺血8h组,缺血12h组,缺血8h+DCM组,缺血12h+DCM组。微针处理组夹毕股动脉确认缺血后即刻使用微针在皮瓣头端从皮瓣内侧扎入。Sham组掀起皮瓣游离血管但无显微血管夹夹毕操作。夹毕血管8h/12h后取出血管夹。术后第七天观察记录皮瓣存活情况,观察完毕后切取皮瓣进行后续组织学HE染色观察。 结果: (1)缺血8小时后皮瓣组织内琥珀酸含量与缺血前相比有十分显著地增长,再灌注30分钟后,琥珀酸含量下降,几乎与缺血前持平;提前给予丙二酸二甲酯的大鼠皮瓣在缺血8小时,再灌注5分钟和30分钟后,与对照组相比,组织内琥珀酸含量均下降。 (2)丙二酸二甲酯和抗氧化应激碳点均能增加脐静脉内皮细胞氧糖剥夺/复氧后的细胞存活率,降低细胞内丙二醛含量以及活性氧水平,提高超氧化物歧化酶活性,抑制细胞凋亡。 (3)负载丙二酸二甲酯和抗氧化应激碳点的微针(DCM)能够提高大鼠缺血再灌注损伤皮瓣术后存活面积,减轻炎细胞的浸润。 结论: (1)琥珀酸在皮肤组织缺血再灌注过程中有一定的代谢规律,表现为在皮瓣组织缺血时堆积,再灌注早期迅速代谢,使用丙二酸二甲酯处理能够抑制皮瓣组织缺血再灌注过程中琥珀酸的异常代谢; (2)负载丙二酸二甲酯和抗氧化应激碳点的微针(DMM/RCDs@MN,DCM)能够改善缺血再灌注皮瓣的预后。