摘要
目的： 研究四川省红原藏族和成都汉族肥胖人群的肠道菌群和粪便胆汁酸谱的分布特征，比较民族或肥胖因素影响下的肠道菌群差异和粪便胆汁酸谱差异，为通过调节肠道菌群改善不同民族肥胖等代谢性疾病的合理途径积累资料。 内容： 1.红原藏族和成都汉族的肥胖及非肥胖人群的肠道菌群差异研究 依托西南区域自然人群队列研究，从收集到粪便样品的红原藏族和成都汉族人群，排除常见高原病、胃肠道疾病、炎性疾病等疾病的患病人群，筛选出符合本研究要求的红原藏族、成都汉族人群，以BMI=28kg/m2为临界点将两部分人群各分为肥胖组（BMI≥28kg/m2）和非肥胖组（18.5kg/m2≤BM＜28kg/m2），作为本部分的研究人群，提取粪便样品DNA，利用IlluminaMiseq平台测定16SrRNA序列，采用Biostack生物信息一体机处理扩增子数据，结合R语言等分析软件进行生物信息学分析，初步探讨红原藏族和成都汉族肥胖及非肥胖人群肠道菌群特征及差异。本部分研究未考虑年龄、性别和抗生素使用情况的影响。 2.匹配样本中红原藏族和成都汉族的肥胖及正常人群的肠道菌群差异研究 在研究人群的基础上，剔除24kg/m2≤BMI＜28kg/m2范围内的样本，然后将两民族人群各划分为肥胖组（BMI≥28kg/m2）和正常组（18.5kg/m2≤BMI＜24kg/m2），在同民族内，计算肥胖组和正常组人群在年龄和性别下的倾向性评分，并进行最邻近匹配，得到1∶1的肥胖组和正常组。得到的匹配样本通过16SrRNA测序，结合生物信息学分析方法，进一步探讨红原藏族和成都汉族肥胖人群的肠道菌群特征，分析在肥胖人群或正常人群中藏汉两民族间的肠道菌群差异，及同民族中肥胖人群与正常人群的肠道菌群差异。 3.匹配样本中红原藏族和成都汉族的肥胖及正常人群粪便胆汁酸谱差异初探 以匹配样本为研究对象，采用超高相液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定藏汉两民族肥胖及正常人群粪便中13种主要胆汁酸亚型的含量，比较肥胖人群或正常人群中红原藏族和成都汉族的粪便胆汁酸谱差异，及红原藏族或成都汉族中肥胖人群与正常人群的粪便胆汁酸谱的差异，并结合肠道菌群测序结果探究肠道菌群-胆汁酸代谢轴与红原藏族、成都汉族肥胖人群的相关性。 结果： 1.红原藏族和成都汉族的肥胖及非肥胖人群肠道菌群特征 经纳入排除标准筛选后，本研究的研究人群中共纳入1120名受试者，划分为四个组：红原藏族肥胖组（n=141）、红原藏族非肥胖组（n=271）、成都汉族肥胖组（n=84）和成都汉族非肥胖组（n=624），粪便DNA提取后进行测序，获得肠道菌群16SrRNA的序列信息。 将16SrRNA的序列信息进行比对分析。α多样性分析结果显示，在红原藏族和成都汉族中，无论基于肥胖人群还是非肥胖人群，红原藏族肠道菌群的物种丰富度及多样性均高于成都汉族，差异具有统计学意义；同民族内，肥胖组与非肥胖组的肠道菌群物种丰富度及多样性差异均无统计学意义。β多样性结果显示，在PCoA和PCA图中，无论是肥胖组还是非肥胖组，红原藏族和成都汉族间肠道菌群结构均有明显差异，但同民族内肥胖组与非肥胖组的肠道菌群结构相似。 在门水平上，以民族为分组因素，发现在丰度位列前八的菌门中，红原藏族肥胖组的放线菌门、拟杆菌门相对丰度高于成都汉族肥胖组，变形菌门、梭杆菌门和单糖菌门的相对丰度低于成都汉族肥胖组；红原藏族非肥胖组的放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门相对丰度高于成都汉族非肥胖组，变形菌门和单糖菌门的相对丰度低于成都汉族非肥胖组，上述差异均具有统计学意义。 在门水平上，以是否肥胖为分组因素，发现在丰度位列前八的菌门中，红原藏族中肥胖组的疣微菌门相对丰度低于非肥胖组，差异具有统计学意义；在成都汉族肥胖组与其非肥胖组的比较中，在厚壁菌门和梭杆菌门的差异具有统计学意义，其肥胖组的厚壁菌门相对丰度低于非肥胖组，而梭杆菌门相对丰度高于非肥胖组。 在属水平上，取任一组内相对丰度＞1%的菌属进行分析。两民族比较，红原藏族肥胖组与成都汉族肥胖组有21个差异性菌属，红原藏族非肥胖组与成都汉族非肥胖组有24个差异性菌属，结合比较，发现藏汉两民族间在肥胖与非肥胖人群中均存在显著差异的菌属有18个；在肥胖与非肥胖的比较中，红原藏族的肥胖组与其非肥胖组有14个差异性菌属，成都汉族的肥胖组与其非肥胖组有3个差异性菌属，两者间未发现明显规律性。 2.匹配样本中红原藏族和成都汉族的肥胖及正常人群的肠道菌群特征 在匹配样本中，共有114名受试者，四个组分别为：红原藏族肥胖组（n=38）、红原藏族正常组（n=38）、成都汉族肥胖组（n=19）和成都汉族正常组（n=19）。对这些样本的肠道菌群16SrRNA序列进行分析。 α多样性分析结果显示，红原藏族肥胖组、红原藏族正常组、成都汉族肥胖组与成都汉族正常组，组间的物种丰富度与多样性差异均不存在统计学意义（P＞0.05）。β多样性分析结果显示，在PCoA和PCA图中，基于肥胖人群或正常人群，红原藏族和成都汉族的肠道菌群结构均显著分离；红原藏族中的肥胖组和正常组的肠道菌群结构也存在一定差异，但成都汉族的肥胖组和正常组之间的肠道菌群群落结构相似。 在门水平上，对丰度位列前八的菌门进行分析。两民族比较中，与成都汉族肥胖组相比，红原藏族肥胖组中拟杆菌门、放线菌门相对丰度较高，变形菌门和单糖菌门的相对丰度较低；与成都汉族正常组相比，红原藏族正常组的拟杆菌门、疣微菌门的相对丰度更高，变形菌门和单糖菌门的相对丰度较低，差异均具有统计学意义；在同民族内肥胖与正常组的比较中，红原藏族肥胖组的疣微菌门相对丰度低于正常组，差异具有统计学意义，而在成都汉族中，丰度位列前八的菌门中，肥胖与正常组差异无统计学意义。 在属水平上，取任一组内相对丰度＞1%的菌属进行分析。红原藏族肥胖组和成都汉族肥胖组中具有统计学差异的物种有18种，红原藏族正常组和成都汉族正常组比较中具有统计学差异的菌属有15种，两民族比较结果在肥胖和正常人群中存在一致性，即无论肥胖或正常，在藏汉两民族间均具有显著差异的菌属有12种：肠杆菌科未分类属（unclassifiedgenusofEnterobacteriaceae）、Clostridium_sensu_stricto、乳杆菌属（Lactobacillus）、厚壁菌门未分类属（UnclassifiedgenusofFirmicutes）、布劳特氏菌属（Blautia）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、Anaerostipes、链型杆菌属（Catenibacterium）、梭菌属ⅩⅧ簇（ClostridiumⅩⅧ）、梭菌纲未分类属（UnclassifiedgenusofClostridia）、Lachnospiracea_incertae_sedis以及霍尔德曼氏菌属（Holdemanella）；而同民族内肥胖与正常组的差异性菌属种类相对较少：在红原藏族中，肥胖组与正常组之间存在相对丰度统计学差异的菌属有8种，红原藏族肥胖组中毛螺菌科未分类属（unclassifiedgenusofLachnospiraceae）、链球菌属（Streptococcus）、厚壁菌门未分类属和多尔氏菌属（Dorea）的相对丰度更高，而肠杆菌科未分类属、埃希氏菌属/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella）、拟杆菌属（Bacteroides）和艾克曼菌属（Akkermansia）的相对丰度较低，而在成都汉族中，肥胖组与正常组间的差异性菌属仅有1种，为小类杆菌属（Dialister）。 通过LEfSe分析，发现在红原藏族肥胖组与成都汉族肥胖组的比较中，放线菌门、普雷沃菌属、乳杆菌属、梭菌目未分类属（unclassifiedgenusofClostridiales）可作为红原藏族肥胖组的生物标志物，变形菌门、拟杆菌属、布劳特氏菌属、肠杆菌科未分类属、埃希氏菌属/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella）可作为成都汉族肥胖组的生物标志物；在红原藏族正常组与成都汉族正常组的比较中，拟杆菌门、普雷沃氏菌属、乳杆菌属可作为红原藏族正常组的生物标志物，变形菌门、肠杆菌科未分类属、布劳特氏菌属、粪杆菌属（Faecalibacterium）、Lachnospiracea_incertae_sedis和Anaerostipes可作为成都汉族正常组的生物标志物；在红原藏族的肥胖组与正常组的比较中，毛螺菌科未分类属（unclassifiedgenusofLachnospiraceae）可作为肥胖组的生物标志物，拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属可作为正常组的生物标志物；在成都汉族的肥胖组与正常组的比较中，仅在正常组中发现小类杆菌属（Dialister）可作为生物标志物。 3.匹配样本中红原藏族和成都汉族的肥胖及正常人群的粪便胆汁酸谱特征 在肥胖或正常的人群中，红原藏族和成都汉族之间粪便胆汁酸谱差异具有普遍性规律：红原藏族的初级胆汁酸、结合型胆汁酸、初级胆汁酸/次级胆汁酸水平显著低于成都汉族，表明红原藏族的肠道菌群更能将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸、将结合型胆汁酸转化为游离型胆汁酸；单个胆汁酸亚型中，红原藏族的CA、CDCA、GCA、GCDCA、TCA、TCDCA和UDCA的含量显著低于成都汉族；但在同民族中，肥胖人群与正常人群的粪便胆汁酸谱比较，呈现出不一样的规律：在红原藏族中，肥胖组的初级胆汁酸、初级胆汁酸/次级胆汁酸、CDCA、GCDCA、TCDCA和UDCA的水平显著高于正常组；而在成都汉族中，各项胆汁酸的含量比较均无统计学差异。通过Spearman相关性分析发现，各个分组内粪便中多种胆汁酸均与多种肠道菌门和菌属存在显著相关关系，但相关性结果在各组间有所不同。 在ROC曲线评价中发现，红原藏族中初级胆汁酸和CDCA的诊断价值较高，作为诊断红原藏族人群肥胖与否的生物标志物，具有一定的准确性；在成都汉族中，HDCA的诊断价值最高，但诊断准确性较低。ROC曲线评价结果辅助说明了红原藏族的肥胖组与其正常组的粪便胆汁酸谱在初级胆汁酸和CDCA上的差异显著。 结论： 1.红原藏族和成都汉族的肠道菌群组成和结构存在明显差异，在肥胖或正常人群中具有共同趋势，提示民族、地域等环境因素对肠道菌群的组成和结构的影响更大，但仍然发现肥胖人群与正常人群肠道菌群的差异，针对不同地区人群提出调节肠道菌群的不同策略，值得进一步研究。 2.红原藏族和成都汉族的粪便胆汁酸变化，在肥胖或正常人群中的特点较为一致。初级胆汁酸、结合型胆汁酸、初级胆汁酸/次级胆汁酸、CA、CDCA、GCA、GCDCA、TCA、TCDCA和UDCA可能成为区分红原藏族和成都汉族粪便胆汁酸谱的差异性标志物；而肥胖人群相较于正常人群的粪便胆汁酸变化，在红原藏族中的特点与在成都汉族中的特点大为不同，粪便胆汁酸在本研究肥胖人群中的作用值得进一步探讨。
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