摘要
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas（CRISPR associated genes）系统是细菌和古生菌为了抵抗噬菌体侵染而进化的一种适应性免疫系统。其中，Cas9蛋白是最具有代表性和目前研究最多的Cas效应蛋白。CRISPR-Cas9具有操作简便、易于设计、成本低以及编辑效率高等优点，被广泛地应用于动物、植物以及微生物的基因编辑。有限的PAM识别范围和脱靶效率是影响Cas9应用的两大难题，因此科学家们使用基于结构的理性设计和半理性设计，定向进化等方法，构建出一系列更优的Cas9突变体。xCas9是David R.Liu通过噬菌体辅助进化得到的一系列Cas9突变体，其中xCas93.7具有更广的PAM兼容性，由5''-NGG-3''扩宽至5''-NG-3''/5''-GAA-3''/5''-GAT-3''。虽然xCas9和RNA以及DNA的三元复合物已被解析，但由于缺乏xCas9的apo蛋白结构，xCas9识别和切割DNA的分子机制尚不清晰。因此，本研究以xCas9为研究对象，探索其识别和切割DNA的分子机制。 本研究的结果如下： 1.将xCas9和iCas9（D147Y，P411T）的突变结合起来，构建了3个xCas9突变体，进行体外酶活测试，xCas9411T和xCas9147Y的PAM兼容性与xCas9相当，酶切效率略差于xCas9。 2.对xCas9，xCas9147Y，xCas9411T结晶尝试，成功解析xCas9411T apo晶体结构；尝试xCas9411T和RNA复合物的结晶，但收集到的衍射数据较差，不能进行结构解析。 3.基于xCas9411T的晶体结构，设计了3个xCas9411T突变体，使REC1结构域变得松散；同时设计了一组半胱氨酸（H137C，I322C）的突变体（xCas9411T-CC），在加入氧化剂/交联剂的作用下形成二硫键之后，REC1结构域变得紧密。 4.通过体外酶切的方法测试了xCas9411T突变体的酶切能力，更加松散的REC1结构域构象使xCas9411T的PAM识别范围和酶切效率都大幅缩小和下降。 5.使用500μM硫酸铜处理xCas9411T-CC和xCas9411T之后，xCas9411T-CC酶切效率明显下降，但xCas9411T无明显变化，推测可能两个半胱氨酸形成二硫键，导致REC1结构域的构象过于紧密，xCas9411T-CC的酶切效率明显下降。 综上所述，本研究成功解析xCas9411T apo的晶体结构，为解释xCas9识别和切割DNA的分子机制提供了结构基础；结合晶体结构和生化实验结果，本研究认为REC1结构域的构象变化与xCas9识别和切割靶标DNA有关，并发挥重要的作用，这为设计出色的Cas9突变体提供了一个新的方向。
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