摘要
近年来工程纳米颗粒（Engineering nanoparticles）被愈加认为是在成像、诊断、药物递送和癌症治疗等方面的有力且有前途的工具，许多配体修饰的纳米粒处于临床试验的过程中。但至今尚未有一种被批准用于临床，其临床转化困难主要是因为纳米粒在体内不可避免地发生了表面生物特征的变化。当纳米粒暴露于生理环境中时，纳米粒将非选择性地吸附各种生物分子，从而形成蛋白冠（Protein corona，PC）。PC赋予了纳米粒的新生物学特性，其改变了纳米粒的整体潜在的诊断或治疗的功能以及它们的毒理学和药理学特征，如循环时间、组织分布和细胞识别等。PC的形成可以显着改变纳米粒的密度、粒径和表面电荷，还可导致纳米粒的“脱靶”、被免疫系统识别、被单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，MPS）清除和肿瘤蓄积降低等。目前，大多数研究仍集中在蛋白冠对靶向药物递送系统（Targeted drug delivery system，TDDS）的影响上，而很少有研究系统地评估合并症对蛋白冠的组成和对纳米粒-蛋白冠复合物靶向性的影响。本研究选择了转铁蛋白（Transferrin，Tf，77kDa）和聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）共修饰的聚苯乙烯纳米粒（Polystyrene nanoparticles，PNs）作为模型TDDS、Ⅱ型糖尿病（TypeⅡdiabetes mellitus，T2DM）作为合并症、非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）作为模型疾病来考察合并症对主动靶向纳米粒的蛋白冠的形成和靶向性的影响。本研究首次提出了T2DM合并症可以改变靶向NSCLC工程纳米粒的蛋白冠组成，并影响纳米粒的体内命运。本研究工作为纳米制剂的研发提供了新思路，为精准医疗趋势下纳米药物的个体化应用提供了重要的参考信息。 第一章的研究工作制备并表征了两种研究用工程纳米粒。首先，使用微乳聚合法合成了含香豆素-6的荧光聚苯乙烯纳米粒，之后对其进行了表面改性，即PEG化和Tf的修饰。制得了PEG化的聚苯乙烯纳米粒（PEG-PNs）和PEG与Tf共修饰的聚苯乙烯纳米粒（Tf-PNs）。对两种研究用工程纳米粒的表征结果为，PEG-PNs的粒径为76.6±0.954nm，ζ-电位为1.0±0.29。Tf-PNs的粒径为81.7±1.357，ζ-电位为0.6±0.08。两组纳米粒质地均一稳定，证明制备成功。 第二章评价了T2DM合并症对靶向NSCLC的纳米粒的体内行为影响。首先建立了T2DM合并NSCLC模型小鼠和NSCLC模型小鼠。之后分别尾静脉注射PEG-PNs和Tf-PNs至小鼠体内，利用小动物活体成像技术（animal vivo imaging technology，AVIT）评价了T2DM合并症状态对NSCLC靶向纳米粒的体内行为的影响。结果表明，T2DM合并症状态会显著提高PNs在肿瘤部位蓄积，影响了PNs的体内行为。本部分实验验证了合并症会改变TDDS体内命运的猜想。 第三章评价了不同的模型小鼠（T2DM合并NSCLC模型小鼠和NSCLC模型小鼠）体内孵育产生的PC对PNs性质和细胞摄取行为的影响。结果表明，PC在PNs表面的覆盖增加了PNs的粒径，改变了PNs的ζ-电位。其次PC中的蛋白含量没有统计学差异，我们可以推测，导致T2DM合并症改变PNs在NSCLC模型小鼠体内命运的原因是PC中蛋白成分的差异，而不是蛋白量的改变。细胞摄取实验结果表明，相比于在单独NSCLC模型小鼠体内孵育得到的PC-PNs复合物（mN-Tf-PNs），T2DM合并NSCLC模型小鼠体内孵育得到的PC-PNs复合物（mND-Tf-PNs）在鼠源非小细胞肺癌细胞（LLC）中有更强的细胞摄取。为了探究PC成分的差异，本研究应用SDS-PAGE凝胶电泳实验和蛋白组学的手段对PC进行了分析。研究表明，不同组PC之间大部分的蛋白质是共有的，但每组均有自己独特的吸附蛋白。每组PC在蛋白组成上有明显差异。mND-Tf-PNs在小鼠肿瘤部位有更多的累积和更长的蓄积时间，其原因可能是它的PC中含有更少的免疫球蛋白、凝血、急性期和补体相关功能的蛋白，从而促进细胞的免疫逃逸，减少其清除，并且具有更长的循环时间。 第四章在体外将T2DM合并NSCLC患者的血浆和NSCLC患者血浆与PEG-PNs和Tf-PNs分别进行了共孵育以形成PC，对T2DM合并症改变PC组成从而影响靶向NSCLC工程纳米粒体内行为的推测进行了验证。结果显示，患者血浆体外孵育PC与模型小鼠体内孵育PC的结果大致相同，即T2DM合并症可以改变PC中的蛋白成分，促进了A549细胞对PNs的摄取，进而改变PNs的体内命运。说明研究具有一定外推性和临床价值。另一方面，体内外PC的结果有部分差异，表明能更好模拟体内状态的实验方法或模型还有待开发。 研究工作首次证明了Ⅱ型糖尿病合并症可以改变靶向NSCLC的工程纳米粒的蛋白冠组成，并影响纳米粒的体内命运。研究工作为纳米制剂的研发工作提供了新的思路，也为靶向纳米药物临床应用提供了重要的参考信息。
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