摘要
植物真菌病害是农作物的主要病害之一。植物病原真菌在侵染植物后，往往会对植株生长造成不利影响。多种植物病原真菌，如链格孢属（Alternariaspp.）真菌和镰刀菌属（Fusariumspp.）真菌还能在侵染农作物后分泌真菌毒素，这些毒素能够通过食物链在人体内积累，影响人类健康。现阶段，植物真菌病害的治理虽仍以化学农药为主，但生物防治手段的出现却有效缓解了农药使用中的多种局限，如药物抗性，环境污染等等。此外，已有多种微生物被成功应用到实际生产生活中。本研究从土壤中筛选出一种白腐真菌——烟管菌（Bjerkanderaadusta），在初步研究中发现烟管菌对灰葡萄孢的生长覆盖现象。因此，初步推测烟管菌可能对植物灰霉病具有防治效果。为了发掘烟管菌作为广谱生物防治因子的能力，本实验以包括灰葡萄孢在内的多种植物真菌病原菌为材料进行相关研究。主要研究结果如下： 1、烟管菌与病原真菌的对峙培养及抗病效果分析。①将10种不同的病原真菌分别与烟管菌进行对峙培养实验，观察到烟管菌对链格孢（Alternariaalternata）SCU-1，链格孢苹果转化型（Alternariaalternataf.sp.mali）SCU-1，细极链格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1，尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum），茄链格孢（Alternariasolani）和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）DY-1具有明显的生长覆盖。此外，在尖孢镰刀菌和灰葡萄孢实验组中观察到明显的病原菌菌丝消融现象；并在液体培养实验中检测到灰葡萄孢，尖孢镰刀菌和茄链格孢菌丝破碎产物对烟管菌几丁质酶活性的诱导。②以灰葡萄孢，细极链格孢和茄链格孢为研究对象，初步研究烟管菌对烟草灰霉病，烟草黑斑病和番茄早疫病的防治效果。结果表明，烟管菌对烟草灰霉病在离体和活体实验中发病面积分别减少91.97%（P＜0.001）和100%（P＜0.001）；对烟草赤星病发病面积在离体和活体实验中分别减少77.12%（P＜0.001）和75.03%（P＜0.001）；对番茄早疫病在离体和活体实验中发病面积分别减少77.43%（P＜0.001）和82.61%（P＜0.001）；对烟草黑斑病没有明显的防治效果。③通过DNA绝对定量实验，发现在接种30天后，烟管菌在大豆根际土壤和烟草叶面的定植率分别为8.57%和6.43%。 2、烟管菌全基因组测序，部分多糖水解酶生物信息学及表达谱分析。①使用二代测序，深度为100×，获取烟管菌全基因组信息。并通过BUSCO分析，比对烟管菌保守核心基因，比中率为96.55%；基因组数据共预测基因11875个，其中注释基因11051个。②11个烟管菌几丁质酶基因均为GH18基因家族，相对分子质量在26720.03至58402.54之间，等电点在4.04至6.86之间，且多为稳定蛋白；5个几丁质酶基因EVM0010419，EVM0005032，EVM0009013，EVM0003825和EVM0003995具有信号肽结构，其中EVM0010419，EVM0009013和EVM0003995属于A类几丁质酶，而剩余二者EVM0005032和EVM0003825为B类几丁质酶。③对烟管菌β-1,3-糖苷酶基因家族进行信号肽预测，在12个β-1,3-糖苷酶基因中仅有三个基因EVM0006890，EVM0003791和EVM0010135可能存在信号肽。④根据信号肽预测结果设计引物，在对峙培养第6天，第16天和第35天，对含有信号肽的几丁质酶和β-1,3-糖苷酶基因进行RT-qPCR表达量分析。其中多个基因表达量上调，特别是几丁质酶基因EVM0005032在与链格孢，茄链格孢，灰葡萄孢和尖孢镰刀菌对峙培养的第6天表达量分别上调27.3倍（P＜0.001）、31.7倍（P＜0.001）、50.3倍（P＜0.001）和41.3倍（P＜0.001）。 3、烟管菌几丁质酶基因BaCHIB（EVM0005032）的真核表达。①几丁质酶基因BaCHIB的信号肽克隆及活性检测，通过酵母信号肽捕获系统，成功检测到该基因信号肽活性。②成功构建去除目的基因信号肽的真核表达载体pPIC9K-BaCHIB-T。③以甲醇作为诱导剂，在毕赤酵母诱导实验第3天和第4天，目的蛋白的表达量达到峰值，但目的蛋白仍然存在于酵母细胞中，没能成功分泌。④使用Ni柱进行亲和层析，并使用80mM咪唑成功洗脱出目的蛋白。⑤37℃条件下，目的蛋白酶活性为17.7U/mg，并在蛋白抑菌试验中表现出明显的抗真菌活性。 本研究初步探究了烟管菌作为生物防治因子潜力，并从烟管菌分泌几丁质酶的角度出发，筛选出具有可能抗真菌活性的烟管菌几丁质酶BaCHIB。不仅拓宽了烟管菌抗菌谱，也为烟管菌作为生防因子，在以后的研究和应用中防治植物真菌病害提供了事实依据和理论基础。
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