摘要
胰腺癌因致死率高、预后差、易复发等特点被认为是“癌症之王”，胰腺癌的治疗至今仍是一个困扰医药学界的难题。化学治疗是胰腺癌临床治疗的重要手段，提高化疗药物递送效率对胰腺癌治疗尤为重要。 纳米药物递送系统（Nanotechnology-based drug delivery system，NDDS）被广泛应用于化疗药物递送，并且展示出广阔的前景，其在改善药物溶解性和降低毒性方面发挥重要的临床作用。但是，NDDS并未在临床上实现基于高通透性和滞留（Enhanced permeability and retention，EPR）效应的增强药效作用，药物递送效率低是限制其药效的重要因素。据报道，静脉注射后，平均只有0.7%的纳米药物能够累积于实体瘤，并且能够渗透进入肿瘤核心并被肿瘤细胞摄取的有效药物浓度将进一步减少。因此，NDDS药物递送效率有很大的提升空间，并且对于增强NDDS药效极为重要。 NDDS的生物学行为在很大程度上取决于其物理化学性质，如化学结构、粒径、表面电荷和形状等。据报道，纤维状胶束可以逃逸网状内皮系统（Reticuloendothelial system，RES）的清除，从而延长循环时间；通过在血流中的翻滚运动促进向血管壁着边，从而增加肿瘤累积；但微米尺度的长度严重限制了其向肿瘤深部组织的渗透和肿瘤细胞的摄取。相比之下，带正电荷的小粒径球状纳米粒适于肿瘤组织穿透和肿瘤细胞摄取，但不利于血液循环、肿瘤累积和保留。因此，一种结合了纤维状胶束和小粒径球状纳米粒优点的NDDS有望实现多阶段提升药物递送效率。 本课题构建了一种基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase2，MMP-2）响应性的串珠状纳米给药系统GD@PPF，以多阶段提升化疗药物递送效率。将胰腺癌临床一线化疗药物吉西他滨（Gemcitabine，GEM）键合于树枝状多聚赖氨酸（Dendrigraft poly-L-lysine，DGL），再修饰一定量的PEG，构建粒径为25nm左右载药球状纳米粒（GD）。再将GD通过MMP-2底物肽GPLGVRG链接于纤维状胶束PEG-PCL表面，形成横径约为30nm，长约1.2μm的串珠状纳米胶束。在血液循环中，GD@PPF拥有类似于纤维状胶束的性质，逃逸RES清除，延长血液循环时间，增加对肿瘤渗漏性血管的选择性累积；到达胰腺肿瘤组织后，在肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TEM）高表达的MMP-2作用下，释放小球状载药GD进行深层穿透并增加肿瘤细胞的摄取。同时，断裂后的纤维状胶束PPF能够包围肿瘤组织和细胞，抑制药物外排，延长化疗药物滞留时间，从而实现了多阶段提升化疗药物递送效率。 本研究从以下五个部分展开。在本课题的第一部分，通过溶剂注入法制备了MMP-2响应性串珠状胶束GD@PPF。GD@PPF横径约为30nm，长约1.2μm，表面电位约为-10mV，并具备良好的血清稳定性、生物相容性及药物缓释性质。此外，经荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）试验、透射电镜考察，GD@PPF具备良好的MMP-2响应性。 在本课题的第二部分，选取Pan02细胞为模型肿瘤细胞，RAW264.7细胞作为模型巨噬细胞，考察两种细胞对Cy5标记的CD@PPF的摄取情况。首先，Western-Blot试验表明Pan02细胞高表达MMP-2，RAW264.7细胞低表达MMP-2。然后通过激光共聚焦、流式细胞仪和荧光定量等手段表明MMP-2响应性串珠状胶束能够减少巨噬细胞摄取，增加肿瘤细胞摄取，并且抑制肿瘤细胞外排，延长药物胞内滞留时间。再用Cy5和FITC分别标记DGL和PEG-PCL（Cy5-DGL/FITC-PEG-PCL），考察其摄取行为，并对其摄取途径进行考察。实验结果表明，小球状CD通过连接于纤维状胶束表面避免巨噬细胞摄取，又通过MMP-2响应性释放促进肿瘤细胞摄取，并且摄取途径呈高度细胞类型和NDDS形态依赖性。 在本课题的第三部分考察了串珠状胶束的药物动力学性质及组织分布情况。实验结果表明，串珠状胶束表现出类似于纤维状胶束的性质，相比于组成相同的球状胶束有更长的血液循环时间并能减少RES（肝、脾）蓄积。在Pan02异位瘤模型中，MMP-2响应性串珠状胶束能够增加肿瘤蓄积并且增强血管外渗透能力。 在第四部分中，Pan02异位瘤模型的体内肿瘤穿透试验表明串珠状不可断裂组CD-FPPF穿透能力最弱，而MMP-2响应性断裂的CD@FPPF与CD@FPPS的Cy5-DGL穿透能力最强且基本一致，表明Pan02异位瘤高表达MMP-2断裂其底物肽，释放小粒径球状纳米粒进行深层穿透。MMP-2响应性释放小粒径球状纳米粒的策略很好地解决了串珠状胶束肿瘤组织渗透能力差的问题。 在本课题的第五部分评价了纳米药物在Pan02异位瘤模型中的体内抗肿瘤效果。实验结果表明，MMP-2响应性串珠状胶束GD@PPF具备最佳抗肿瘤效果，归因于其多阶段提升药物递送效率，不仅延长血液循环时间，增加肿瘤组织选择性累积，还增强肿瘤组织穿透，增加肿瘤细胞摄取并延长保留时间。 综上所述，本研究构建了一种肿瘤微环境响应性串珠状纳米给药系统，能够多阶段提升药物递送效率，显著增强化疗药物抗肿瘤效果，具有较高的参考价值和应用前景。
NETL