摘要
缺血性脑卒中是一种严重的脑部疾病，也是导致人类死亡的主要原因之一。然而，目前对于该疾病的治疗策略存在诸多不足。因此研发可有效防治缺血性脑卒中的药物，是药学工作者迫切需要解决的问题，具有十分重要的临床意义。缺血性脑卒中发生时，由于严重的低灌注，会引起神经元细胞兴奋性中毒与氧化损伤，导致血脑屏障功能障碍、微血管损伤及细胞内Ca2+超载，进而启动缺血后炎症反应。 α-细辛脑是中药石菖蒲的主要活性成分之一，其具有广泛的药理作用，如抗炎、镇痛、抗癫痫、促进神经祖细胞增殖，抑制细胞外Ca2+内流等。我们大胆推测：α-细辛脑对缺血性脑卒中可能具有治疗作用。 目前市售的α-细辛脑剂型有片剂和注射剂，片剂溶出度差，生物利用度仅3~5%；注射液采用吐温80与丙二醇为溶剂，这些溶剂易导致机体出现严重的不良反应，极大的限制了其临床应用。据此，本课题将α-细辛脑制备成亚微乳注射液，鉴于乳剂处方中的大豆油、磷脂易分解产生有害杂质，可能对制剂的安全性与稳定性产生不良影响，故我们重点对其稳定性进行了考查。在此基础上，通过构建SD大鼠MCAO模型，对α-细辛脑亚微乳进行了体内抗缺血性脑卒中的药效学研究。此外，我们使用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）构建氧糖剥夺（OGD）模型，评价了α-细辛脑对于缺血性脑卒中体外细胞模型的效果。以期为该类疾病提供新的候选药物与治疗策略。 第一章对α-细辛脑亚微乳的制备及其稳定性进行了研究。采用高压均质法制备3批α-细辛脑亚微乳注射液，通过检测Zeta电位、粒径、多分散系数、含量、pH值对其药剂学特性进行表征。结果显示，该制剂的Zeta电位为-32.5±1.2mV，粒径为308.1±5.3nm，多分散系数为0.13±0.03，含量为14.7±0.2mg?mL-1，pH值为6.5±0.4。以中国药典（2015版）中游离脂肪酸、过氧化值、甲氧基苯胺值为指标，对α-细辛脑亚微乳注射液的稳定性进行了考查。留样3个月后，检测结果如下：游离脂肪酸含量为0.32±0.02，过氧化值为0.60±0.07，甲氧基苯胺值为4.62±0.05，均符合药典规定的限度要求；其Zeta电位为-34.5±1.1mV，粒径为305.3±3.4nm，多分散系数为0.11±0.03，含量为14.6±0.2mg?mL-1，pH值5.6±0.1。上述研究结果表明，α-细辛脑亚微乳注射液稳定性良好。 第二章对α-细辛脑在缺血损伤细胞模型中的保护作用进行了研究。首先筛选了α-细辛脑和连二亚硫酸钠（Na2S2O4）的最佳作用浓度，选择α-细辛脑10、25、50μg?mL-1作为后续实验给药浓度；选择依达拉奉（0.1μM）作为阳性对照；连二亚硫酸钠20mM作为最佳损伤浓度。其次，采用连二亚硫酸钠和低糖DMEM培养基构建PC12细胞氧糖剥夺模型。氧糖剥夺2h后，为模拟缺血后再灌注；模型组和对照组培养基更换为含2.5%胎牛血清的DMEM高糖培养基，给药组更换培养基为含药DMEM高糖培养基（含2.5%胎牛血清），继续培养24h。采用MTT法检测各组细胞的生存能力；采用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。研究结果显示，α-细辛脑各浓度均能显著提高氧糖剥夺损伤的PC12细胞的生存能力（P＜0.0001），且可显著抑制细胞凋亡（P＜0.01），提示其对于缺血性细胞损伤模型，具有良好的保护作用。 第三章评价了α-细辛脑亚微乳体内抗缺血性脑卒中的作用，并探讨其相关作用机制。通过改良线栓法建立了SD大鼠MCAO模型，随机分为假手术组、模型组、α-细辛脑亚微乳（低剂量组Xmg?kg-1、中剂量组Ymg?kg-1、高剂量组Zmg?kg-1）、依达拉奉组（3mg?kg-1）、丁苯酞组（10mg?kg-1)。缺血2h后，拔出栓线恢复血供，即通过尾静脉注射上述药物或空白乳剂。采用GarciaJH神经功能评分标准，对大鼠进行神经功能评分；采用TTC染色法，检测脑缺血再灌注24h后大鼠脑梗死体积；此外，对造模后大鼠的癫痫并发率进行统计比较。 同法建立MCAO大鼠模型，按上述方案分别给药处理。采用HE染色法，观察梗死脑组织周围皮层细胞形态和数量；采用尼氏染色法检测皮层细胞中尼氏小体的数量；采用TUNEL染色法，检测大鼠梗死脑组织周围皮层细胞中凋亡细胞数；采用免疫组化法，检测大鼠梗死脑组织周围皮层LC3；采用免疫荧光技术，观察海马区GFAP、Iba-1表达。采用激光散斑血流成像仪，分析大鼠脑组织相对血流量。此外，对造模大鼠每日给药1次，评价不同治疗组的14天生存率。研究结果表明，α-细辛脑亚微乳显著改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能（P＜0.05），且呈现剂量依赖性；显著减小脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积（P＜0.05），降低MCAO大鼠的癫痫发病率（P＜0.05），提高脑缺血再灌注大鼠的生存率（P＜0.05），改善缺血脑组织的相对血流量（P＜0.05）。机制研究结果提示，α-细辛脑发挥抗缺血性脑卒中作用可能与其减少脑组织神经元损伤，抑制神经元细胞凋亡，降低脑组织内GFAP、Iba-1、LC3蛋白的表达有关。 综上所述，α-细辛脑亚微乳通过调节脑缺血再灌注后GFAP、Iba-1、LC3蛋白的表达，可抑制神经元凋亡，减少神经元损伤和坏死，减小脑梗死体积，进而改善缺血性脑卒中模型大鼠的神经功能，提高其生存率。据此，我们预期其有望成为具有良好应用前景的治疗缺血性脑卒中的候选药物。
NETL