摘要
背景与目的 恶性黑色素瘤是一种具有高转移率、高死亡率的恶性肿瘤。临床上的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗和免疫治疗。传统的手术治疗受限于恶性黑色素瘤的分期，并不适用于每一位患者，且术后容易复发；恶性黑色素瘤细胞对放射线不敏感，放射治疗通常仅作为一种辅助治疗手段；化学药物治疗会产生严重的毒副作用，降低患者生存质量，而且易产生耐药，降低治疗效果。近年来，以阻断PD-1（ProgrammedDeath-1）/PD-L1（ProgrammedDeath-Ligand1）通路为代表的免疫疗法在恶性黑色素瘤患者的治疗中取得了一定的成功。然而，免疫检查点抑制剂受限于肿瘤局部较低的CD8+T细胞浸润水平，以及复杂的免疫抑制微环境，只有部分患者（20-40%）对免疫检查点抑制剂疗法有反应。因此，开发基于免疫检查点的联合疗法，将肿瘤细胞的直接杀伤作用与促进肿瘤微环境CD8+T浸润和效应功能，以及改善免疫抑制微环境相结合，提高恶性黑色素瘤免疫治疗效果成为亟待解决的关键问题。 越来越多的研究表明，蒽环类抗生素、奥沙利铂等传统化疗药物不仅能产生细胞毒性作用直接杀伤肿瘤细胞，而且还能诱导部分肿瘤细胞钙网蛋白（Calreticulin,CRT）暴露，释放ATP和高迁移率族蛋白1（High-mobilitygroupbox,HMGB1）等。其中，ATP已被证实能够招募抗原呈递细胞（Antigen-presentingcells,APCs），然后后者通过CD91与CRT结合而摄取肿瘤抗原；HMGB1已被证实为一种Toll样受体4激动剂，可以促进APCs的激活和成熟。因此，将这些能够改善肿瘤细胞免疫原性的传统药物与阻断PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂疗法联用，有可能达到既杀伤肿瘤细胞，又能启动抗肿瘤免疫应答以促进CD8+T细胞反应持续抑制肿瘤细胞生长的双重抗肿瘤效果。但仍需要注意的是，治疗药物以可溶性注射剂的形式给药往往需要较高的剂量或者多次给药才有可能在肿瘤局部达到足够的药物浓度，而高剂量的药物通常会导致全身毒性。 脂质体由于其良好的生物相容性，有效的药物递送能力而备受关注。但是，常规脂质体并不能按需释放药物而限制了它们的进一步应用。相比之下，能够在特定条件下精准释放药物的刺激响应脂质体因其药物释放在时间和空间上的独特性而更可能在临床治疗中获得成功。这些脂质体中通常包含能够控制脂质双分子层稳定性和渗透性的环境响应性基团。多种内源性生理环境（例如低pH值，较高的氧化还原酶活性或某种生物标记物）和外源性刺激（例如放射线和高温等）都可能为脂质体药物响应释放提供必要的条件。因此，在本研究中，我们以将直接杀伤肿瘤细胞与增强肿瘤抗原特异性免疫反应相结合，改善恶性黑色素瘤免疫治疗效果为目的，构建了一种肿瘤微环境响应的智能脂质体纳米载体，从而将肿瘤免疫原性死亡诱导药物米托蒽醌（Mitoxantrone,Mit）和PD-L1免疫检查点抑制剂（anti-mousePD-L1antibody,aPD-L1）共递送到肿瘤局部，以期实现在降低药物毒副作用的同时，将免疫原性化疗和免疫检查点阻断相结合，增强恶性黑色素瘤免疫治疗效果。我们期望本研究能够为肿瘤微环境响应的纳米药物用于增强肿瘤免疫治疗提供新的思路和研究基础。 方法 1.米托蒽醌诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡的实验验证 为了明确Mit是否能够诱导B16-F10免疫原性死亡，首先通过免疫荧光实验和流式细胞术在体外检测了Mit引起的CRT暴露，通过酶联免疫吸附实验（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）和生物发光定量法分别检测了Mit引起的B16-F10细胞HMGB1和ATP的释放水平；将Mit作用的B16-F10细胞与体外诱导培养的骨髓来源树突状细胞共孵育，通过流式细胞术检测成熟的树突状细胞比例；Mit作用的B16-F10细胞作为疫苗，通过预防性免疫实验验证Mit作用的细胞是否促使小鼠产生保护性免疫反应。 2.共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体制备和表征 将4-十二烷基苯胺、苯酚、1,3-二溴丙烷和二乙胺作为原料，依次通过重氮偶合反应、卤代反应和霍夫曼烷基化反应合成了偶氮衍生物AZO，并通过核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱对终产物进行结构鉴定。通过硫酸铵梯度法制备不同AZO摩尔比的载Mit脂质体Mit@AZO-Lipo（MAL），并通过包封率、载药量、粒径、PDI和稳定性等因素筛选最优的MAL处方。然后，将aPD-L1与DSPE-PEG2000-NHS通过酯键连接以形成胶束，并利用后插入法将胶束嵌入MAL中以制备MPAL（Mit@aPD-L1/AZO-Lipo）。进一步通过流式细胞术，BCA试剂法以及紫外-可见分光光度法分别评价了MPAL中aPD-L1的插入效率，抗体浓度以及药物包封率和载药量，并通过粒径分析检测了MPAL在日常储存和高浓度血清中的稳定性。 3.共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体还原响应性以及靶向性研究 将Na2S2O4作为偶氮还原酶体外模拟试剂，通过动态光散射法和透射电镜研究了MPAL的还原响应性，并通过透析法研究了MPAL还原响应性释放Mit的能力；通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察研究了B16-F10对MPAL的靶向摄取作用。此外，建立了小鼠B16-F10皮下移植瘤模型，通过活体成像实验研究了荧光分子DiD标记的脂质体在荷瘤小鼠体内分布情况。 4.小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型和肺转移模型的建立，治疗及作用机制研究 建立小鼠B16-F10皮下移植瘤模型，通过记录治疗后小鼠的肿瘤体积增长曲线，瘤重等研究了MPAL对荷瘤小鼠的治疗效果，并在观察终点通过血生化分析评价了脂质体制剂的肝脏、肾脏和心脏毒性；通过Hamp;E染色和免疫荧光分析了肿瘤细胞的凋亡和CRT暴露情况。利用表达荧光素酶的B16-F10细胞建立了小鼠黑色素瘤肺转移模型，通过小动物活体成像，肺组织离体拍照，转移结节计数以及Hamp;E染色等实验评价了MPAL对肺转移模型的治疗效果 为了研究MPAL的化疗免疫治疗机制，综合评价化疗免疫治疗对适应性免疫反应的影响，通过流式细胞术对经MPAL治疗后的小鼠肿瘤微环境中CD3+CD4+T细胞，CD3+CD8+T细胞，CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞、CD11c+CD91+树突状细胞，以及肿瘤引流淋巴结中的CD11c+CD103+树突状细胞等免疫细胞进行分析，使用ELISA对血清中TNF-α和IFN-γ浓度进行检测。 5.小鼠黑色素瘤术后转移和复发模型的建立，治疗和作用机制研究 为了建立更加贴近临床的黑色素瘤术后转移模型，使用MPAL治疗荷瘤小鼠两天后，对小鼠肿瘤进行了手术切除，利用流式细胞术检测脾脏中，CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞等免疫细胞比例，评价治疗后小鼠产生的系统性免疫反应。此外，也使用MPAL治疗荷瘤小鼠两天后，对小鼠肿瘤进行了手术切除，并在小鼠背部对侧接种肿瘤，模拟术后转移。通过肿瘤体积增长曲线和瘤重分析研究了MPAL的预防肿瘤术后转移的效果。 按照类似的方法，对治疗后的小鼠肿瘤进行手术切除。小鼠无瘤生存十天后，检测了脾脏中CD3+CD8+CD44+CD62L-效应记忆T细胞和CD3+CD8+CD44+CD62L+中枢记忆T细胞比例，评价治疗后小鼠产生的免疫记忆。此外，对治疗后的小鼠肿瘤进行手术切除，小鼠无瘤生存十天后，在背部对侧接种肿瘤，模拟术后复发。通过肿瘤体积增长曲线和瘤重分析研究了MPAL预防肿瘤术后复发的效果。 结果 1.米托蒽醌能够诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡 Mit能够诱导B16-F10细胞CRT暴露，促进细胞释放HMGB1和ATP等损伤相关分子模式，并存在一定的浓度依赖性。浓度为1μM的Mit作用B16-F10细胞24小时后能够上调树突状细胞共刺激因子CD86的表达。此外，Mit作用的B16-F10细胞能够促使小鼠产生保护性免疫反应，肿瘤平均生长抑制率达到70%。这些结果证明Mit能够有效诱导B16-F10细胞免疫原性死亡。 2.成功制备了共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体 成功合成了偶氮苯衍生物AZO，且核磁共振氢谱，碳谱和高分辨质谱结果显示AZO的结构正确。该材料能够快速响应肿瘤微环境中的偶氮还原酶而发生偶氮键的断裂以形成氨基芳烃。综合了粒径、稳定性、包封率和载药量等因素筛选了AZO:Choleterol:DSPE-mPEG2000=60:35:5的摩尔比例用于制备MAL，并且流式结果显示AZO亲水头部叔胺具备一定的佐剂效应。进一步通过后插入法成功制备了共载Mit和aPD-L1的脂质体纳米药物MPAL。体外研究结果显示，MPAL在4℃条件下或高浓度血清中稳定性较好，能够快速响应还原剂Na2S2O4而发生脂膜破裂，释放Mit。AZO的存在赋予了脂质体更好的稳定性和智能还原响应性。此外，细胞摄取实验发现MPAL能够通过受体/配体介导的内吞作用促进Mit快速进入胞内。活体荧光成像研究显示，MPAL表面的aPD-L1赋予了其更好的黑色素瘤靶向能力，从而证实我们构建的脂质体实现了免疫原性死亡诱导药物和免疫检查点抑制剂的肿瘤靶向性共递送。 3.共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体有效抑制了小鼠黑色素皮下移植瘤和肺转移瘤的生长 在B16-F10皮下移植瘤模型中，MPAL组小鼠肿瘤平均抑制率达到87%，展现出相比游离药物组，普通脂质体组以及MPL组更加显著的疗效。这体现了MPAL能够在肿瘤微环境响应性释放Mit，使得Mit在肿瘤局部药物浓度更高，增强了Mit的治疗效果。此外，aPD-L1阻断PD-1/PD-L1后能够通过免疫系统的调节达到更好的治疗效果。同时，血生化检测结果表明，该治疗手段不会引起各项检测指标明显变化，并未造成明显的心脏和肝肾毒性。在B16-F10肺转移模型中，经过MPAL治疗的小鼠肺部肺泡结构和肺泡壁受影响程度较轻，无大面积的肿瘤细胞转移，肿瘤转移结节数明显少于MAL组和PBS组。 4.共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体有效抑制了小鼠黑色素瘤术后转移和复发 在更为贴近临床的黑色素瘤术后转移和复发模型中，未经治疗组小鼠均出现肿瘤转移和复发，而经过MPAL治疗后，小鼠脾脏中CD3+CD8+T细胞以及CD8+CD44+CD62L-效应记忆T细胞比例显著升高，表明MPAL通过促进体内产生有效的系统性CD8+T细胞反应和免疫记忆。此外，MAL组术后转移和复发率仅为16.7%，显著低于PBS组，并且出现转移和复发的小鼠肿瘤体积增长速率低于PBS组和MAL组。结果表明MPAL显著抑制了肿瘤术后转移和复发。 5.共载米托蒽醌和PD-L1抗体的还原响应脂质体抗肿瘤免疫机制 经MPAL治疗的小鼠肿瘤微环境中，CD8+T细胞在肿瘤浸润性T细胞中的比例达到33.96±7.71%，相比PBS组增加了4倍。此外，MPAL组小鼠肿瘤微环境Treg的浸润显著少于PBS组，且MPAL组相比PBS能够显著增加CD8+CTL与Treg的比例。对DC的分析发现，CD91阳性细胞占DC细胞比例为14.22±3.97%，显著高于PBS组，也显著高于MAL组。肿瘤引流淋巴结中，MPAL组CD103+DC比例为61.84±7.89%显著高于PBS组，也显著高于MAL组。这些结果表明MAPL在杀伤肿瘤细胞的同时，诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，促进了抗肿瘤免疫级联反应的发生，增强了荷瘤小鼠的治疗效果。 结论 综上所述，本论文对肿瘤微环境响应的智能脂质体纳米药物的构建及其对恶性黑色素瘤化疗-免疫联合治疗应用和免疫效应机制进行了系统性研究。研究结果表明肿瘤微环境还原响应的MPAL脂质体纳米药物平台能够将免疫原性死亡诱导药物与免疫检查点抑制剂靶向共递送至肿瘤局部，在降低药物毒副作用的同时，将直接杀伤肿瘤细胞、促进抗肿瘤免疫应答和改善免疫抑制微环境相结合，在黑色素瘤皮下移植瘤模型，肺转移模型以及更加贴近临床的术后转移和复发模型中均取得较好的治疗效果。本论文研究为解决免疫检查点抑制剂在恶性黑色素瘤免疫治疗中面临的关键问题提供了新的应对策略，也为化疗-免疫治疗在其他肿瘤的治疗应用中提供了新的思路。
NETL