摘要
研究背景及目的 在法医学研究及实践中，损伤时间的推断对于案件的还原有相当重要的意义。然而，到目前为止，还没有找到能够准确反应早期损伤时间的分子靶标，因此，在法医病理学中寻找能准确判断损伤时间的方法十分重要，并且也是目前研究的热点和难点。以往在法医学实践中通常是通过对机体损伤的大体检查及组织病理学检查来确定损伤时间，这些常规方法在法医学实践中虽有一定的应用价值，但往往只能大致推断损伤时间，准确性及重复性较差，且在早期损伤时间的推断上存在不足，往往不能满足法医学工作的需要。因此，寻找新的能准确推断早期损伤时间的参考分子成为损伤时间推断研究的重中之重。近年来，在法医学研究中发现miRNAs分子链短，具有稳定性较好、不容易降解、组织特异性好、检材损耗小和可以与DNA共提取等特点[1-3]，是良好的法医病理学分子靶标。目前miRNAs在法医学领域的应用前景虽已开始受到关注，但有关研究仍然较少，许多miRNA分子虽然具有潜在的应用价值，但在实际应用中的可行性还有待进一步研究加以确定。此外，有研究表明某些miRNA在损伤皮肤中表达上调[3]，可能与皮肤损伤修复相关，对此，课题组通过miRNAs芯片技术对小鼠皮肤切创后可能存在差异性表达的miRNA分子进行筛选，结果显示miR-6412在小鼠损伤皮肤中可能存在差异性表达，为进一步研究确定该分子在小鼠切创皮肤中时序性差异性表达规律，本研究通过创建小鼠皮肤切创模型，在损伤后不同时间点提取创口皮肤组织，通过qRT-PCR技术对小鼠切创后创口皮肤中miR-6412表达量进行定量检测，同时将正常对照组及切创后不同时间节点的各实验组进行统计学差异性分析，将小鼠切创后创口皮肤中miR-6412表达量与损伤时间进行相关性分析并建立回归方程，从而确定miR-6412在小鼠皮肤切创早期损伤时间推断中的应用前景，以及其在人类皮肤早期损伤时间推断研究中的意义，目的是为法医病理学早期损伤时间推断研究及实践寻找新的分子靶标和实验依据。 实验材料及方法 SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠66只（成都恩斯维众实验动物有限公司提供），周龄为9～11w，体重为22～27g，随机分为11组，其中10组实验组，1组对照组，每个组均为6只小鼠。小鼠采用异氟烷进行麻醉，将背部去毛处理裸露皮肤，使用碘伏消毒后在小鼠背部居中处做一纵行切口，切口长1.0cm，深达筋膜，制造小鼠皮肤全层切创模型。切创完成后将每只小鼠单只分笼进行饲养，密切观察创口，预防感染。分别于造创后1h、2h、4h、8h、12h、24h、3d、5d、7d及10d共10个时间点将小鼠断颈处死，取伤口处1.5cm×1.0cm大小皮肤组织，其中取80mg皮肤组织样本用锡纸包裹皮肤样本后液氮速冻，放置于-80℃冰箱内保存，以备后续qRT-PCR定量分析检测。剩余皮肤样本用4％多聚甲醛中固定48h，按常规病理取材、切片，以备HE染色。对照组未进行切创处理，直接断颈处死后于背部对应部位取皮肤组织样本。 miRNA定量分析，取小鼠损伤皮肤组织样本进行总RNA提取，应用miScript(R)ⅡRTKit将所提取样本RNA进行逆转录反应，生成cDNA，再采用miScript(R)SYBRGreenPCRKit对miR-6412进行qRT-PCR定量分析。 统计学分析中，采用IBMSPSSStatistics25软件进行分析，由于各组皮肤切创样本中miR-6412相对表达量不服从正态分布，因此选择非参数检验对各组样本组织中miR-6412相对表达量进行统计学差异性分析，以P＜0.05代表差异具有统计学意义，P＜0.01代表差异具有显著统计学意义，同时对小鼠损伤皮肤中miR-6412相对表达量与损伤时间进行相关性分析和回归分析并建立回归方程。 结果 1.qRT-PCR结果：各组小鼠皮肤样本中miR-6412相对表达量组间具有统计学差异性(P＜0.05)。 2.各组小鼠皮肤样本中miR-6412表达水平统计学差异性分析结果：小鼠皮肤切创后2h、4h及8h组与正常对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，2h组与3d、7d及10d组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），4h组与3d组之间比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01），4h组与7d、10d组之间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），8h组与3d组之间比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01），8h组与7d、10d组之间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 3.相关性分析结果：小鼠皮肤切创后miR-6412相对表达量与损伤时间相关性具有统计学意义（P＜0.05），相关系数为0.360347，相关强度不高，可能与样本数量偏少有关。 4.小鼠皮肤切创后miR-6412相对表达量时序性变化规律：小鼠皮肤切创后1hmiR-6412表达量开始下调，2h达到最低值，2~8h期间维持低表达，8h之后表达量开始回升，3d时接近正常对照组水平，3d之后表达水平围绕正常对照组水平上下波动，但波动幅度较小，与正常对照组比较均不具有统计学差异性。 5.小鼠切创皮肤样本组织病理学检查结果：小鼠皮肤切创后0~4h未见炎细胞浸润，创周见少量出血，8h创口及其周围出现较多炎细胞，创口处见炎性渗出物及坏死组织，此后从12h至24h炎症范围逐渐向创口处聚集，创口中心出现大量炎细胞，3d创周及创底见肉芽组织生长，5d创面基本修复，被覆表皮细胞。 结论 1.小鼠皮肤切创后2~8h期间miR-6412表达水平显著下调，可作为小鼠皮肤损伤早期损伤时间推断的分子标记，在小鼠损伤皮肤中检测到其表达量显著下调时提示损伤时间在2~8h的可能性较大。 2.小鼠皮肤切创后miR-6412的表达水平存在先下降后升高的时序性变化规律，其在3d之内的表达变化规律与回归方程y=0.061x2－0.432x＋1.087拟合度较高，miR-6412在小鼠损伤皮肤中表达变化规律表明miR-6412可作为人类皮肤损伤时间推断研究的参考指标。 3.小鼠皮肤损伤后miR-6412表达量与损伤时间之间具有统计学意义相关性，但由于样本数量偏少，相关性强度较低，因此还需进一步研究加以验证。通过扩大样本量及对miR-6412在人体损伤皮肤中的表达情况进行进一步研究，有望为早期损伤时间推断找到新的分子靶标。 4.小鼠皮肤切创4h以前未发生明显形态学改变，组织病理学检查难以区分损伤时间，还需结合分子学检查加以判断，miR-6412可以很好的弥补损伤早期组织病理学检查的不足。
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