摘要
目的： 肝内胆管细胞癌（ICC）是恶性程度较高的恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈显著上升趋势。根治性手术切除目前仍是ICC唯一可能的治愈手段。但约60%的患者在检出时就已发生转移，失去了手术切除的机会。因此，ICC患者的生存预后较差，5年生存率不及40%。因此，深入探究ICC进展过程中的分子机制，对提高患者预后有重要的临床意义。 越来越多研究表明，炎症在ICC的发生及进展中扮演重要角色。白细胞介素-6（IL-6）是一种多效性的细胞因子，可在应激和炎症刺激下产生。IL-6可以通过诱导抗凋亡和增殖相关基因的表达调控ICC的进展。有研究表明，IL-6亦可通过诱导非编码RNA的表达进而促进肝细胞癌的增殖及转移。环状RNA（circRNA）是一类丰富的共价闭合的单链转录物，其参与多种生理和病理过程。随着分子生物学的进展，越来越多的环状RNA被证实是具有功能的生物分子，在细胞增殖、迁移或侵袭等生物过程中发挥重要功能。最近的研究表明，异常表达的circRNA在多种实体肿瘤的发生及进展中具有显著的调控作用。然而，circRNA是否在炎症介导的ICC进展中发挥作用目前尚不清楚。 因此，本研究旨在探究IL-6诱导的circRNA cGGNBP2（来源于ggnbp2基因，将它命名为cGGNBP2）在ICC细胞增殖及转移中的作用及其分子机制。 材料和方法： 第一部分中，首先，通过收集160例ICC患者血清IL-6水平及临床病理和生存资料，分析IL-6与ICC患者预后生存的关系。随后，使用IL-6刺激ICC细胞，并通过高通量测序筛选出差异表达的circRNA cGGNBP2。通过实时荧光定量聚合酶链反应检测cGGNBP2在ICC临床组织中的表达并分析其与患者临床病理特征和生存预后的关系。结合转录组测序及RNA免疫共沉淀技术初步探讨cGGNBP2的成环机制。最后，通过体外细胞增殖、周期、迁移及侵袭实验和体内动物模型检测cGGNBP2对ICC细胞增殖及转移的影响。 第二部分中，通过circRNADb预测cGGNBP2的开放阅读框及核糖体进入位点（IRES）。随后，利用质谱分析和免疫印迹验证并鉴定了cGGNBP2所编码的蛋白cGGNBP2-184aa。通过设计IRES突变的质粒验证了cGGNBP2通过其编码的蛋白发挥生物学功能。最后，通过体内外实验进一步明确cGGNBP2-184aa对ICC细胞恶性生物学表型的调控作用。 第三部分中，利用高通量测序探究了cGGNBP2-184aa调控的信号通路。并利用质谱分析明确了与cGGNBP2-184aa相互作用的蛋白。通过免疫印迹、免疫荧光及双荧光素酶报告基因实验验证了cGGNBP2-184aa调控的信号通路。随后，通过设计一系列截短突变质粒结合免疫共沉淀进一步探讨了cGGNBP2-184aa调控该通路的具体机制。最后，在临床组织及动物实验组织样本中验证了上述实验结果。 结果： 通过临床数据分析发现，ICC患者血清IL-6水平越高，生存预后越差。使用IL-6刺激ICC细胞可显著上调cGGNBP2的表达。通过分析cGGNBP2在ICC组织中的表达，发现cGGNBP2高表达与恶性肿瘤特征及较差的生存预后密切相关。组织中cGGNBP2高表达是ICC患者总体生存和无复发生存的独立危险因素。通过比对内含子序列，发现cGGNBP2侧翼内含子区存在高度反向互补配对序列（RCM）。转录组测序结果显示IL-6可下调RNA结合蛋白DHX9的表达。DHX9通过结合于RCM上调控cGGNBP2的生物合成。体内外实验结果表明cGGNBP2可在体内外水平显著促进ICC细胞增殖及转移。 通过circRNADb，预测了cGGNBP2具有一个开放阅读框及IRES区，并利用双荧光素酶报告基因实验验证了IRES的活性。利用质谱分析鉴定出了cGGNBP2编码的包含184个氨基酸的蛋白：cGGNBP2-184aa。随后，设计了IRES点突变质粒，并进行细胞增殖、迁移及侵袭实验和体内动物实验。实验结果表明，cGGNBP2通过其编码的cGGNBP2-184aa在体内外水平促进ICC细胞的恶性生物学表型。 转录组测序和通路富集分析结果表明cGGNBP2-184aa可显著正向调控JAK-STAT信号通路。免疫沉淀结合质谱分析结果显示cGGNBP2-184aa的62-122氨基酸区域可与STAT3的DNA结合域相互作用。cGGNBP2-184aa可通过促进STAT3的Tyr705位点发生磷酸化、二聚化并转入细胞核启动STAT3下游靶基因的转录。IL-6、cGGNBP2-184aa和STAT3形成一个正反馈回路促进ICC的进展。最后，在ICC组织及皮下移植瘤样本中验证了cGGNBP2-184aa与STAT3Tyr705的相关性 结论： 我们的研究发现了一个IL-6促进ICC进展的新机制：IL-6通过诱导cGGNBP2的表达促进ICC增殖及转移。cGGNBP2的生物合成受DHX9的调控。cGGNBP2可编码一个新的蛋白cGGNBP2-184aa，该蛋白与STAT3相互作用并激活JAK-STAT信号通路，最终IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成正反馈回路促进ICC细胞恶性生物学表型。本研究揭示了IL-6促进ICC进展的新机制，为临床中以IL-6/STAT3为靶标的治疗提供了新的思路。
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