摘要
作为固生生物，植物只能通过自身进化出精确的调控机理来适应非生物胁迫和恶劣的环境，例如高温、低温、高盐和干旱等。植物激素脱落酸（ABA）在植物应答非生物胁迫如盐胁迫和渗透胁迫中起着重要调控作用。同时，ABA还能通过控制气孔的运动来调节植物对干旱的响应。在各种非生物胁迫信号途径中，转录因子往往起着承上启下的作用，它们感知、传递和转导外界逆境信号，调节逆境应答基因的转录，以此来调控植物对恶劣环境的响应。因此，对转录因子的研究不仅有助于人们了解植物如何应对非生物胁迫，还能进一步完善植物对逆境信号应答的调控网络。 转录因子DREB2s在植物应对高温胁迫、低温胁迫和干旱胁迫中起着重要作用。该家族的DREB2A/2B在植物应对高温、低温以及盐胁迫过程中的功能已经被研究的比较透彻。然而，该家族在ABA信号途径中的功能报道甚少。目前，只有DREB2C被报道过参与ABA信号通路，但具体机制以及它的蛋白质翻译后修饰情况仍然不清楚。因此，本论文就DREB2C在ABA信号途径中的功能和作用机制进行了详细的分析。 本论文首先构建并鉴定了DREB2C转基因株系，发现DREB2C在拟南芥幼苗形态建成阶段作为正调控因子参与ABA信号的传递。外源ABA处理促进DREB2C的表达并增强其蛋白质的稳定性，从而提高了DREB2C过表达株系中下游ABA应答基因的转录。进一步的分析证实DREB2C在拟南芥体内能够被泛素化降解。随后，以DREB2C为诱饵，通过酵母双杂交筛选到一个未知的C3H2C3构型的RING结构E3泛素连接酶（At5g43200）是DREB2C的互作蛋白。随后通过免疫共沉淀和荧光双分子互补实验发现二者在体内外的确存在相互作用，因此，将其命名为DEL1（DREB2C-DegradingE3Ligase1）。本文通过基因表达分析表明DEL1的表达受ABA和NaCl诱导，体外泛素化实验表明DEL1能将自身泛素化，原生质体瞬时表达实验发现DEL1-GFP融合蛋白定位在细胞核和细胞质中。进一步的植物生理性状和表型分析证明DEL1作为负调控因子参与ABA介导的拟南芥幼苗形态建成。此外，本文证明了DEL1在体外能够泛素化DREB2C的K9、K172、K194、K196、K216和K335位氨基酸残基。 本文通过生物信息学方法发现一个DEL1的同源基因，At3g28620，编码一个未知的C3H2C3构型的RING结构E3泛素连接酶，基因表达分析表明该基因同样受到ABA和NaCl的诱导。体外泛素化实验表明该蛋白同样能够将自身进行泛素化，蛋白质定位分析证实该蛋白定位于细胞核和细胞质中。同时，通过免疫共沉淀和荧光双分子互补技术证明该蛋白和DREB2C在体内外都存在相互作用，因此，将其命名为DEL2。植物生理性状和表型分析证明DEL2在拟南芥幼苗形态建成阶段负调控ABA信号的传递，并且在拟南芥中过表达DEL2能够降低ABA处理后COR15A、RD29B和RAB18的表达。此外，本文还证明了DREB2C的的K9、K11、K194、K196、K216和K335位氨基酸残基能够被DEL2泛素化。 本论文进一步分析了DREB2C与DEL1/2的遗传学上下游关系。通过对DEL1/2转基因植物、各种突变体以及双重突变体植物株系的表型、生理性状以及ABA应答基因表达分析，发现以DREB2C过表达植株为背景过表达DEL1或DEL2会降低DREB2C过表达植株对ABA的敏感性，并降低了ABA处理后DREB2C过表达株系中COR15A、RD29B和RAB18的转录水平。而以dreb2c突变体植株为背景过表达DEL1或DEL2则提高了dreb2c突变体植株对ABA的耐受性，同时也降低了ABA处理后dreb2c突变体中COR15A、RD29B和RAB18的转录水平。因此，遗传学上下游关系分析表明DREB2C位于DEL1/2的下游。 为了分析DEL1/2与DREB2C之间的具体作用机制，本文利用半体外和体内降解实验表明DEL1/2能够泛素化DREB2C并通过26S蛋白酶体途径将其降解；同时，利用EMSA和染色质免疫共沉淀分析技术，证明DREB2C可以结合到DEL1/2启动子中的DRE核心元件上，调控它们的表达。因此，DEL1/2能泛素化降解DREB2C，而DREB2C则能调控DEL1/2的转录，从而协同调控植物对ABA信号的应答。 综上，本论文鉴定并描述了能够泛素化DREB2C的E3连接酶DEL1/2。当ABA存在时，DREB2C受诱导表达，蛋白水平得到积累，从而提高ABA响应基因的表达，开启ABA信号通路；同时，DREB2C能够促进DEL1/2的转录，而DEL1/2则通过泛素化途径参与DREB2C的降解，关闭ABA信号通路。因此，本研究表明DREB2C在拟南芥幼苗形态建成阶段，正调控ABA信号通路；同时，DEL1/2通过泛素化DREB2C负调控ABA信号。
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