摘要
目的： 随着我国人口老龄化与生活方式的变化，糖尿病发病率逐年升高，中国的糖尿病患者数量已占全球的1/4。且，糖尿病及其相关的慢性并发症，严重影响患者生存质量，甚至导致患者残疾、死亡。糖尿病做为巨大的公共卫生问题，对其发生发展及治疗的研究具有非常重要的医学价值和社会意义。 90-95%的糖尿病为2型糖尿病（Type2DiabetesMellitus，T2DM）。其发病原因很多，包括胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷等，最终导致细胞葡萄糖摄取减少，血糖升高，引发T2DM。因此，因胰岛素刺激的葡萄糖转运能力下降所致的葡萄糖摄取减少在胰岛素抵抗发生发展中具有重要作用。 葡萄糖转运子4（Glucose transporter4，GLUT4）是体内最主要的对胰岛素信号响应的葡萄糖转运子，主要分布在胰岛素的靶组织如脂肪、骨骼肌。GLUT4的表达异常和胞内转运异常均会导致胰岛素抵抗的发生。在没有胰岛素刺激时（基础状态），GLUT4主要分布于胞内膜状结构形成的区隔中，如反面高尔基网状结构（trans-Golgi network，TGN）、GLUT4储存囊泡（GLUT4storage vesicle，GSV）；在胰岛素刺激下，GLUT4储存囊泡在转运蛋白和调节因子的作用下向细胞膜方向运动、并与之融合，GLUT4分布到细胞膜上发挥生理功能，将细胞外葡萄糖转运入胞内。GLUT4在胰岛素刺激下的转位需要大量的转运蛋白及调节因子参与，任何影响GLUT4转位的因素均可能导致胰岛素抵抗，进而引起细胞摄取葡萄糖减少、机体血糖升高。 前期文献分析发现，脂肪细胞中，驱动蛋白5B（kinesin family5B，KIF5B）参与GLUT4沿微管的运输，肌球蛋白5（Myosin5，MYO5）参与其沿微丝的运输，sortilin参与GLUT4囊泡的形成并调节GLUT4囊泡对胰岛素的敏感性。以上这些蛋白也被报道与亨廷顿蛋白相关蛋白1（hungtingtin-associated protein1，HAP1）在神经元和胰岛β细胞中存在相互作用。 HAP1是最先被发现并鉴定的亨廷顿蛋白（huntingtin，Htt）结合蛋白，是分子马达的组成部分之一，主要表达于中枢神经系统，也高表达于含氮激素内分泌细胞。研究已证实HAP1与多种转运蛋白存在相互作用，参与蛋白细胞内运输、囊泡转运和膜受体内吞作用。HAP1通过调节多种蛋白的转运，如雄激素受体、脑源性神经营养因子、GABA受体等，从而发挥不同的生理调节作用。 课题组前期实验发现HAP1敲减小鼠体重增长较正常小鼠快，易肥胖，给予高脂喂养后，其高血糖的发生较正常小鼠更快且更严重，暗示HAP1敲减影响了小鼠的糖代谢，加剧了高脂诱导下小鼠高血糖的发生，可能与T2DM的发生有密切关联。 基于上述文献分析和预实验结果，我们提出以下假说：HAP1参与胰岛素靶细胞脂肪细胞GLUT4的转位，其缺失可能造成GLUT4转位障碍，继而导致胰岛素抵抗，最终促进糖尿病的发生发展。 针对上述假设，本课题拟从动物、细胞、分子等层面，研究：（1）HAP1在糖尿病状态下的表达；（2）HAP1表达下降对小鼠糖代谢的影响；（3）HAP1与脂肪细胞内GLUT4转位的关系及其调节机制，旨在探明HAP1对T2DM发病的影响，从全新的角度丰富T2DM发病机制的研究，并为其预防和治疗提供有价值的实验室依据。 方法： 1.HAP1在脂肪组织的表达及其在糖尿病状态下的表达变化： （1）小鼠脂肪组织HAP1的表达：实时荧光定量PCR、western blot、免疫荧光等方法检测小鼠脂肪组织HAP1的表达； （2）糖尿病小鼠脂肪组织HAP1的表达：给予野生型C57小鼠（wild type，WT）高脂饲料喂养进行糖尿病造模，确认造模成功后取脂肪组织，实时荧光定量PCR、western blot检测HAP1的表达水平； （3）糖尿病病人白细胞HAP1mRNA表达：收集糖尿病病人白细胞，RT-PCR检测HAP1mRNA表达水平。 2.HAP1对小鼠糖代谢的影响： （1）HAP1敲减对糖代谢的影响：繁育HAP1敲减（HAP1+/-）的转基因鼠，监测体重及糖代谢相关指标（葡萄糖耐量和胰岛素耐量）； （2）高脂饮食条件下，HAP1敲减对糖代谢的影响：HAP1+/-小鼠进行高脂喂养，监测体重及糖代谢相关指标（葡萄糖耐量和胰岛素耐量）； （3）HAP1敲除对脂肪细胞糖摄取的影响：取HAP1+/-鼠雌雄杂交，产生HAP1敲除（HAP1-/-）的新生鼠。取皮肤培养分离成纤维细胞，并诱导分化成脂肪细胞，给予100nM胰岛素刺激后检测其糖摄取变化。 3.HAP1对GLUT4转位的影响及机制： （1）HAP1敲除的脂肪细胞GLUT4的分布：原代HAP1-/-成纤维细胞诱导成脂肪细胞，饥饿2h后给予100nM胰岛素刺激，30min后固定细胞，荧光染色，观察GLUT4分布； （2）HAP1敲除的脂肪细胞GLUT4上膜量检测：胰岛素刺激30min后的HAP1-/-脂肪细胞，试剂盒分离膜蛋白，western blot检测膜蛋白中的GLUT4含量； （3）HAP1和GLUT4质粒共转染细胞后，HAP1与GLUT4定位观察：HEK293细胞共转染HAP1A-CFP和GLUT4-mCherry质粒，荧光观察HAP1与GLUT4共定位； （4）小鼠脂肪组织HAP1和GLUT4定位观察：小鼠脂肪组织HAP1和GLUT4免疫荧光双染，观察HAP1与GLUT4共定位； （5）HAP1与GLUT4在共转染细胞和小鼠脂肪组织中的相互作用：对HEK293和脂肪组织内的HAP1与GLUT4进行免疫共沉淀，检测HAP1与GLUT4的相互作用；siRNA干扰sortilin，探讨其在HAP1与GLUT4互作中的作用。 结果： 1.HAP1在脂肪组织的表达及其在糖尿病状态下的表达变化： （1）实时荧光定量PCR、western blot及免疫荧光均证实脂肪组织表达HAP1。 （2）给予高脂喂养9个月后，小鼠空腹血糖达到7.3mmol/L，达到糖尿病诊断标准（＞7mmol/L），糖尿病造模成功。糖尿病模型小鼠脂肪组织HAP1表达较正常对照组显著下降：HAP1mRNA水平下降60%，蛋白水平下降50%。 （3）糖尿病病人白细胞HAP1mRNA表达量仅为正常人的30%。 2.HAP1对小鼠糖代谢的影响： （1）常规喂养条件下：HAP1+/-小鼠体重增加率较WT鼠显著升高；WT鼠葡萄糖耐量曲线在30min时达到峰值，而HAP1+/-小鼠葡萄糖耐量峰值提前至15min；胰岛素刺激后血糖HAP1+/-小鼠下降速率较WT鼠缓慢，且在刺激后90min不能回复至空腹水平，胰岛素耐量曲线异常。 （2）高脂喂养条件下：高脂组HAP1+/-小鼠体重增加率较高脂组WT鼠显著升高，出现明显的肥胖。高脂组HAP1+/-小鼠葡萄糖及胰岛素耐量曲线下面积均较高脂组WT鼠显著升高；高脂组HAP1+/-小鼠葡萄糖耐量曲线峰值延后至60min，120min时血糖值不能回复至空腹水平，且显著高于同时间点的高脂组WT鼠血糖值；胰岛素刺激30min后维持喂养的WT小鼠血糖下降50%，高脂组WT鼠血糖下降33%，而高脂HAP1+/-小鼠血糖仅降低22%。 （3）WT原代脂肪细胞胰岛素刺激后葡萄糖摄取量增加50%，而HAP1-/-脂肪细胞胰岛素刺激前后葡萄糖摄取量无差异。 3.HAP1对GLUT4转位的影响及机制： （1）免疫荧光结果显示，胰岛素刺激后WT脂肪细胞GLUT4在细胞膜上分布增多，HAP1-/-脂肪细胞膜GLUT4则未见增加。 （2）对膜GLUT4蛋白定量检测结果显示，胰岛素刺激后WT脂肪细胞膜GLUT4含量增加1.9倍，HAP1-/-则未改变。 （3）在双转HAP1和GLUT4质粒的HEK293细胞中观察到两种蛋白的共定位，同时在脂肪组织的免疫荧光双染中也观察到HAP1和GLUT4的共定位。 （4）免疫共沉淀检测HAP1与GLUT4的相互作用，结果显示：在GLUT4的免疫共沉淀复合物中检测到HAP1蛋白，在HAP1的免疫共沉淀复合物中检测到GLUT4蛋白。同时在GLUT4和HAP1的免疫共沉淀复合物中均检测到sortilin蛋白，而在sortilin的免疫共沉淀复合物中也能检测到GLUT4和HAP1蛋白。干扰sortilin的表达后，HAP1与GLUT4的相互作用减弱。 结论： 1.小鼠脂肪细胞表达HAP1； 2.糖尿病的发生发展与HAP1的表达下调有关； 3.HAP1缺失导致胰岛素刺激下脂肪细胞GLUT4向细胞膜的转位障碍，影响脂肪细胞胰岛素刺激的糖摄取； 4.HAP1可通过sortilin的介导与GLUT4相互作用，参与脂肪细胞内胰岛素刺激的GLUT4转位。 综上所述，在小鼠脂肪细胞中，HAP1与GLUT4存在相互作用，参与GLUT4转位。HAP1缺失导致胰岛素刺激的GLUT4上膜减少，细胞糖摄取减少，导致机体出现胰岛素抵抗，进而引发糖尿病。
NETL