摘要
研究目的： 随着中国经济发展，人民生活方式和饮食结构发生较大变化，代谢异常引起的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为中国第一大慢性肝脏疾病。NAFLD全球患病率达到了普通人口的1/4，而肝脏疾病死亡率的增加与NAFLD的增加相关联。长期的疾病负担给患者带来巨大的经济负担，且尚缺乏有效的药物。由于NAFLD是导致肝硬化及肝癌发生的主要因素，因此预防及治疗NAFLD能够有效降低肝硬化和肝癌的发病风险，有助于提高中国人民的生活质量。 淫羊藿素（icaritin，ICT）是传统中药淫羊藿提取物中主要组分淫羊藿苷（icariin）的体内水解产物。Icaritin具有多种药理作用，比如对乳腺癌，肝细胞癌的抑制作用，还能抑制血管内血栓及血管外脂质沉积，以及抗氧化作用，但是对于NAFLD的治疗作用尚无报道。前期研究发现icaritin能在细胞水平缓解脂质沉积，但机制不明，因此本研究致力于探索icaritin对NAFLD的药理作用机制。 已经证实，肝脏中AMPK酶活性的下降、肝细胞自噬功能的缺乏、肝内氧化应激的出现等，是NAFLD发病的重要原因。大量研究表明NAFLD的发展与性别有关，且有证据表明雌激素在肝脏疾病中发挥保护效应。Icaritin被报道具有雌激素样作用，前期研究也发现icaritin对ER阳性和ER阴性的乳腺癌细胞发挥不同药理作用。因此，本文推测icaritin可能通过雌激素受体，发挥调控AMPK活性，从而诱导自噬，调节氧化应激，最终发挥缓解脂质沉积的药理作用。 研究方法： 本研究总共分为五个部分进行。第一部分探究了icaritin对于NAFLD动物模型的作用。利用高脂饲料（HFD）喂养SD大鼠12周构建NAFLD动物模型，然后灌胃给药icaritin持续9天，麻醉取血取材，分析血清生化指标，通过苏木精-伊红（Hamp;E）染色和油红O染色分析肝脏的病理学改变。 第二部分探究icaritin对肝细胞脂肪沉积模型的作用。Icaritin处理模型细胞24h后，利用油红O染色、尼罗红染色对模型细胞内脂滴的变化进行评价，再使用β-半乳糖苷酶染色探究icaritin缓解细胞衰老的作用，二氢乙啶（DHE）染色后利用流式细胞仪分析icaritin对细胞内活性氧（ROS）的影响。 第三部分探究icaritin对于脂代谢相关蛋白表达水平变化的影响。利用免疫组化和蛋白免疫印迹实验技术分别在大鼠肝脏组织与L02细胞上验证了icaritin对脂质合成相关蛋白如脂肪酸合酶（FAS）、甾醇调节元件结合转录因子1（SREBP1）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC），及其磷酸化后p-ACC表达的调控。同时还检测了icaritin对抗氧化作用的超氧化物歧化酶1（SOD1），醌受体氧化还原酶1（NQO1）表达的影响。 第四部分分析icaritin对于自噬的影响以及AMP活化蛋白激酶（AMPK）在其中发挥的作用。分别利用免疫荧光检测自噬点的变化，利用蛋白免疫印迹检测了Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1），及p-ULK1、LC3、AMPK、p-AMPK的表达。转染ptf-LC3质粒，检测自噬流是否通畅，最后使用自噬抑制剂，AMPK活性抑制剂进一步验证AMPK激活对于icaritin发挥药理作用的重要性。 第五部分是初步验证雌激素受体α（ERα）与icaritin的关系。利用分子对接的方法检测两者结合位点。使用雌激素受体抑制剂他莫昔芬（TAM）进一步验证icaritin发挥药理作用的机制。 研究结果： 1.Icaritin缓解了HFD诱导的NAFLD大鼠肝脏的脂肪变性，降低了肝脏指数，降低了大鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）含量。 2.Icaritin减少了L02模型细胞内脂滴的聚集，缓解了细胞衰老，并减少了细胞内ROS的产生。 3.Icaritin在组织和细胞水平均下调FAS、SREBP1的表达，并在细胞水平促进ACC磷酸化，加快脂肪酸氧化分解，同时升高抗氧化酶SOD1、NQO1蛋白的表达。 4.Icaritin激活细胞自噬，并使自噬流通畅，能够磷酸化AMPK，并在AMPK受到抑制的情况下便不再发挥减少脂质沉积，减少细胞内ROS产生等药理作用。 5.分子对接结果显示icaritin在亮氨酸第346位和组氨酸第524位残基与ERα形成氢键，利用他莫昔芬抑制ERα活性后，icaritin不再发挥降低脂质沉积与减少ROS生成的药理作用。 研究结论： Icaritin通过与ERα结合，磷酸化AMPK使其激活，从而下调脂质合成相关酶的表达，减少脂质合成，同时诱导细胞自噬，增加多余脂质的降解而缓解脂质沉积，同时icaritin还增加抗氧化酶类的表达，降低细胞内ROS的水平从而缓解氧化应激。本研究为icaritin应用于治疗NAFLD提供了重要的理论基础。
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