摘要
生防芽孢杆菌是一种环境友好型生防细菌，可以抑制多种植物病原真菌的生长。目前的生防芽孢杆菌因为其存在生防效果不稳定、见效慢、定殖能力差、对环境要求高、不耐露天恶劣环境等问题，无法满足实际需求，因而限制了其实际应用。本实验室前期研究中从俄罗斯引进了一株能较好抑制植物病原真菌的芽孢杆菌菌株，命名为生防芽孢杆菌1841。本研究以芽孢杆菌1841为研究对象，开展了其生物学性状、诱变选育、诱变菌株生防效果增强分子机制、转录组分析及突变位点基因编辑验证、诱变菌株防治植物真菌病害的效果等研究。主要研究结果如下： 1.芽孢杆菌1841的鉴定及抑菌性能评估 芽孢杆菌1841通过16SrDNA及gyrA、gyrB基因测序、构建系统发育树，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。平板对峙实验发现，B.amyloliquefaciens1841能够抑制多种植物病原真菌的生长，其抑制灰霉菌的能力强于市售枯草芽孢杆菌。B.amyloliquefaciens1841的抑菌作用可能是通过产生并分泌至胞外的抑菌物质改变病原真菌菌丝的完整性和通透性，从而抑制病原菌菌丝和菌体生长。 2.B.amyloliquefaciens1841的诱变选育 以B.amyloliquefaciens1841为起始菌，通过常温常压等离子体（ARTP）和伽马射线辐照连续诱变，筛选出三株抑菌能力明显增强的突变菌株，分别命名为M18、M73和M11。与起始菌1841相比，突变菌株M18、M73及M11抑制灰霉菌的抑菌圈分别提高46%、52%、58%。经过发酵液各成分抑菌实验分析，B.amyloliquefaciens1841抑菌物质主要为脂肽类化合物。与1841相比，突变株M18、M11抑菌脂肽浓度分别提高31%、16%；与1841相比，相同浓度的M73、M11抑菌脂肽的抑菌效果均提高37%。3株诱变菌株在连续培养5代后，抑菌能力没有降低，具有遗传稳定性。 3.B.amyloliquefaciens诱变菌株生防作用增强机制 出发菌株B.amyloliquefaciens1841和三株诱变菌株发酵产生的脂肽经分离纯化，进行高分辨率电喷雾质谱分析。结果显示，脂肽中主要成分为IturinA、IturinB、BacillomycinD、BacillomycinL、SurfactinA、SurfactinB、SurfactinC、FengycinA及其同系物。与起始菌株相比，诱变菌株脂肽成分中的Iturin、Surfactin及Fengycin的比例更高，诱变菌株在分子量少于1000的位置增加了新的脂肽成分Kurstakins和Bacillibactin，且出现更多的Iturin、Surfactin及Fengycin家族同类物，长碳链同系物也增加，这应该是诱变菌株抑菌作用提高的直接原因。进一步对1841进行全基因组测序和诱变菌株重测序，3株诱变菌株共筛选到12个有效突变基因位点，分别为pb2B：青霉素结合蛋白2B；ynfM：内膜转运蛋白；norR：厌氧一氧化氮还原酶转录调节因子；gutR：葡糖醇操纵子转录调控因子；ybfQ：转录含有硫氰酸酶；atpA：ATP合成酶A亚基；etfP：EamA家族转运蛋白；ywdK：细胞膜膜蛋白；yqeW：钠离子/阴离子协同转运蛋白；pstC：磷酸盐跨膜转运蛋白以及2个噬菌体蛋白基因。上述突变基因不是之前报道的脂肽合成基因簇基因，却显示可以来研发诱变菌株，提高抑菌能力。通过分析突变类型、基因代谢网络及蛋白质结构和功能改变，从中筛选出ynfM、pb2B、norR、atpA和ywdk5个对抑菌性状影响可能性较大的基因进行进一步研究。 4.诱变菌株转录组分析和基因编辑验证部分突变位点的功能 通过对1841、M18和M73进行转录组测序，对起始菌株和诱变菌株进行差异表达基因分析发现，细胞膜组分基因、碳水代谢相关基因、转运蛋白相关基因、次生代谢相关基因表达差异最大。分析KEGG代谢通路上的差异基因发现，在磷酸转移酶、ABC转运子、磷酸肌醇代谢、糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢上的基因表达差异最大，这些结果与推测的可能基因突变位点及抑菌性状表现基本吻合。为进一步验证上述5个突变基因的作用，我们利用芽孢杆菌CRISPR基因编辑载体，对1841进行基因编辑，得到2株单基因敲除的编辑菌株1841ΔynfM和1841Δpb2B，1株基因双敲除的编辑菌株1841ΔynfMΔpb2B，及3株单基因点突变的编辑菌株1841MnorR、1841MatpA和1841Mywdk。通过比较编辑菌株和起始菌株1841的抑菌圈、脂肽产量及脂肽抑菌效果的差异，发现3个基因单独点突变对1841的抑菌性状没有显著影响，而ynfM和pb2B基因的失效可以提高B.amyloliquefaciens1841的脂肽产量20%左右。 5.诱变菌株M73防治植物真菌病害初步研究 在实验室条件下，M73、1-MCP和海藻酸钠联用可以在常温下延缓软枣猕猴桃果实成熟5天左右，水分丧失不超过10%，抑制病原真菌的生长达到90%以上，延长软枣猕猴桃的货架期1周左右，表明诱变菌株具有很好的应用前景。
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