摘要
环氧化合物的(S)-和(R)-对映体都是合成活性药物，天然产物，精细化学品和高级聚合材料的重要中间体。目前传统的化学合成法对于内部烯烃或带有官能团的烯烃的环氧化具有极其优异的对映选择性，但是对末端烯烃的对映选择性不足。而生物催化中，利用苯乙烯单加氧酶SMO，细胞色素P450单加氧酶，过氧化物酶和烯烃单加氧酶均能以中等至优异的对映选择性催化末端烯烃的环氧化。其中，苯乙烯单加氧酶具有极其出色的对映选择性，但是存在重大局限性：几乎所有已知的SMO都是单一的(S)-选择性，且目前已知的功能主要是环氧化和硫醚氧化两大类。 直到最近，本课题组从链霉菌Streptomycessp.NRRLS-31的基因组中发现并报道了第一个(R)-选择性的SMO(StStyA)，该酶能催化苯乙烯及四个衍生物的环氧化反应，生成相应的(R)-环氧化合物，其ee值为91-99%。但是该酶对于苯乙烯的催化活性较低，且ee值仅为91%，而工业化应用通常要求ee值必须大于98%。同时StStyA只能催化间位取代的苯乙烯，但是对于邻位和对位取代的苯乙烯均无催化活性。因此寻找更多(R)-选择性新酶是很有必要的。基于此，本课题主要从寻找(R)-选择性新酶和开发SMO新反应两个方面来进行了研究。 为了挖掘(R)-SMO新酶，我们首先以StStyA的氨基酸序列为探针，在NCBI数据库进行了BLAST搜索，获得了一系列相似度为49-90%之间的功能未表征的假定蛋白序列，并结合目前已报道的28个(S)-SMO以及StStyA进行了系统发育分析，结果显示进化树可以分为四个分支，传统的(S)-SMO分类为Ⅰ组和Ⅱ组，而潜在的SMO新酶分类为Ⅲ组和Ⅳ组。根据亲缘关系，从组Ⅲ和组Ⅳ总共选取了21个新酶作为目标序列，构建了这些新酶和还原酶PsStyB的共表达质粒。通过全细胞催化体系检测了新酶对苯乙烯的催化活性，结果发现了10个有活性的新酶，其中2个(S)-SMO和8个(R)-SMO。这8个(R)-SMO新酶全部聚类在Ⅳ组。对其进行基因簇分析后发现，它们的来源菌株中不具有传统苯乙烯单加氧酶相关的苯乙烯降解基因簇。通过多序列比对发现这8个新酶具有传统SMO的保守结构域，同时发现不同选择性的SMO在46号（AaStyA编号）氨基酸位点有很大的不同，其中(S)-SMO在该位点主要是丝氨酸/苏氨酸和亮氨酸，而(R)-SMO在该位置为苯丙氨酸，随后通过定点突变研究，发现将(S)-SMO和(R)-SMO在46号位点氨基酸互换时，酶的对映选择性会发生翻转，该结果首次证明了Phe46是一个关键的氨基酸残基，对SMO的对映选择性有很大影响。 在8个(R)-SMO新酶中，SeStyA（来源于Streptomycesexfoliatus）、AaStyA（来源于Amycolatopsisalbispora）和PbStyA（来源于Pseudonocardiaceae）三个酶在催化活性或对映选择性方面性能优异，为了探究其实际应用潜力，我们对其进行了详细表征。这三个酶在表达与纯化时，每升培养基分别可以获得200mg、60mg和15mg的SeStyA、AaStyA和PbStyA纯酶。随后我们测定了它们的动力学常数，结果显示三个新酶在催化苯乙烯环氧化时与已报道(S)-SMO的活性相当。SeStyA、AaStyA和PbStyA具有广泛底物谱，可以将一系列的苯乙烯类似物转化为相应的(R)-环氧产物。其催化性能有一定的互补性，其中SeStyA和AaStyA具有良好的催化活性和的底物谱，产物对映体过量最高可达＞99%ee；而PbStyA在催化活力方面表现不佳，但是具有极其优异的对映选择性，绝大部分情况下，产物对映体过量＞99%。有趣的是，SeStyA和AaStyA这两个新酶在催化对位取代的苯乙烯衍生物时，构型发生反转，生成了(S)-环氧产物。同时，我们还考察了表达量较高的SeStyA在其他一系列底物中的反应情况。包括其他苯乙烯类似物，杂环类芳香族烯烃，非共轭烯烃、硫醚等，进一步拓展了(R)-SMO的底物谱。 为了提升(R)-SMO新酶的性能，我们选取活力最高的SeStyA进行了热稳定性改良研究。利用在线软件ConsensusFinder预测了潜在的稳定替换位点，选择一致性＞70%的12个位点作为目标，构建获得了12个单突变子和1个双突变子SeM2。测定其残余活力后发现，4个单突变子以及SeM2的稳定性较野生型有所提高。将这6个位点组合后，筛选获得了最优组合突变子SeM6。其在50℃时的热失活半衰期是野生型的5倍，相对活力约为野生型的1.5倍，最适反应温度由45℃提高到50℃，而且产物光学纯度与野生型相当。SeM6的可溶性表达量较野生型有显著提高，每升培养基可获得250mg纯酶。在催化4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃的环氧化反应时，野生型SeStyA在10mmol/L底物浓度下，在40℃反应6小时，转化率为50%；而相同浓度的SeM6粗酶3小时即可完全转化10mmol/L底物；而且当底物浓度为20mmol/L时，SeM6粗酶3小时转化率也可达到80%。显然催化性能提升的突变子将显著增强SeStyA的应用潜力。 在研究SMO催化的新反应方面，受Achmatowicz氧化重排反应机理的启发，我们以2-呋喃-2-丙醇作为模式底物，选择了一系列不同来源的SMO，考察其反应情况。结果显示有5个酶能催化2-呋喃-2-丙醇生成新产物。对该产物进行分离鉴定后，确定其为二氢吡喃酮，是预期中的Achmatowicz氧化重排反应的产物。经纯酶反应体系验证后，确认该重排反应是SMO催化氧化的结果。在底物谱拓展研究中，采用PsSMO的粗酶体系检测2-呋喃-2-丙醇类似物的反应情况，发现该酶仅对呋喃乙醇具有很低的活性，而对呋喃甲醇和呋喃乙胺不具催化活性。为了探究与该重排反应相关的关键残基，通过蛋白与底物的分子对接，定点突变以及活性检测，我们还发现了一系列对酶催化Achmatowicz反应活性有极大影响的位点。 综上所述，通过本论文的研究，我们首次揭示了一个(R)-SMO的新进化分支，鉴定了一组(R)-SMO新酶，为合成光学纯的(R)-环氧化合物提供了新的合成工具和绿色方法；而对SMO新反应的研究则突破了传统，首次证实了SMO在Achmatowicz重排反应中的重要作用，进一步拓展了SMO的应用范围。
NETL