摘要
背景： 肝纤维化是不同病因所致的慢性肝脏疾病的共同病理过程，其发生的主要原因是肌成纤维细胞活化后，分泌大量的细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM），ECM的过度累积最终形成肝纤维化。进展性肝纤维化患者会发展为肝硬化，有可能发展为肝癌，并可能死于肝衰竭。因此，如何使肝纤维化甚至早期肝硬化逆转，恢复正常的结构和功能，或延缓纤维化的进程，已经成为非常重要的科学问题。目前，尽管针对不同疾病已经开发并成功地使用了一些特定的治疗方法，例如直接抗病毒药物治疗丙型肝炎，但仍然没有有效和特定的抗纤维化治疗方法。 锌是人体必需的微量元素，具有促进生长发育，抗炎，抗凋亡等多种生物学功能。大量的临床及实验室动物模型研究报道，慢性肝病，肝硬化与锌缺乏密切相关，慢性肝脏疾病及肝硬化病人的肝脏普遍缺锌。在我们团队之前的研究中，采用硫酸锌溶液对胆管结扎构建的胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型进行补锌，发现补锌能够有效抑制肝纤维化的进程。 然而，直接补充硫酸锌溶液的锌会广泛分布在各组织中，正常组织的细胞摄入锌过多则会产生毒性作用，可能存在着一定的风险，而且直接补充硫酸锌溶液并未达到逆转肝纤维化的效果。为了使肝纤维化甚至早期肝硬化逆转，恢复肝组织的结构和功能，我们尝试通过改进补锌的方式而实现比直接补充硫酸锌溶液更好的抗肝纤维化效果。脂质体作为目前最具前景的药物载体之一，结构类似于生物膜的囊泡，可直接进入细胞，也可吸附于靶细胞外层，能够被生物自身的分解酶代谢降解，不良反应少，具有良好的生物相容性、靶向性和控制药物释放的优点。脂质体是常规用于将药物递送至病理部位的载体材料。脂质体容易在肝脏聚集，且易停留在炎性部位。目前，已有研究表明脂质体能有效特异递送药物至肝脏，增强药物的抗肝纤维化效果。因此，我们假设脂质体可将锌有效特异递送至肝纤维化的肝脏中，从而有利于锌发挥抗肝纤维化的作用，实现肝纤维化的逆转。于是，我们采用脂质体作为药物载体，来运载硫酸锌，并将这种负载硫酸锌的脂质体复合物称为锌脂质体（ZincSulfate-LoadedLiposomes，Lip-Zn），锌脂质体是否具有逆转肝纤维化的作用，我们对此展开了研究。 目的： 研究在胆汁淤积性肝纤维化小鼠和恒河猴模型中，锌脂质体逆转肝纤维化的作用，并进一步探索相关机制，为肝纤维化的治疗提供一种潜在的新方法。 方法： 1.锌脂质体的表征。本研究采用的锌脂质体由本实验室前期制备，采用粒度仪测定锌脂质体的粒径，透射电镜观察其形态，凝胶色谱法将未包封的锌与含锌的脂质体分离而计算包封率，采用透析袋法评价药物的体外释放。 2.锌脂质体安全剂量的探索。对正常小鼠给予不同剂量（2.5mgZn2+/kg，5mgZn2+/kg，10mgZn2+/kg，20mgZn2+/kg）的锌脂质体，通过单日内尾静脉注射，然后观察14天，期间观测小鼠的毒性反应和体重，实验结束后对小鼠的生存情况进行了分析，结合生存率和体重变化率确定安全剂量。 3.脂质体对药物肝脏保留时间的影响。对正常小鼠给予安全剂量的锌脂质体（5mgZn2+/kg），在不同时间点取肝脏，原子吸收光谱法（Atomicabsorptionspectroscopy，AAS）检测锌浓度。 4.脂质体递送对锌在小鼠体内分布的影响。对正常小鼠给予锌脂质体（5mgZn2+/kg），在静脉注射48h后，取心、肝、脾、肺、肾和脑，同时取未给予任何干预的小鼠的相同组织，AAS检测各组织锌浓度，从而判断脂质体主要将锌递送至何组织。 5.锌脂质体对肝纤维化小鼠的作用及机制。 （1）小鼠模型的建立：通过胆管结扎（Bileductligation，BDL）构建胆汁淤积性肝纤维化模型，假手术（Sham）组不进行结扎，其余处理相同。术后4周取材，将肝组织石蜡包埋切片后进行HE染色和天狼猩红（Siriusred，SR）染色，并根据HE结果进行METAVIR评分系统判断肝纤维化程度，根据SR染色结果统计小鼠肝脏的胶原面积比（collagenproportionalarea，CPA）；血清学通过酶检测试剂盒检测反映胆汁淤积的总胆红素（Totalbilirubin，TBIL），以及反映肝损伤的丙氨酸氨基转移酶（Alanineaminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartateaminotransferase，AST）。 （2）锌脂质体对胆汁淤积性肝纤维化小鼠的作用：术后4周所有小鼠进行活体取血，检测TBIL，根据TBIL和体重进行随机分组。锌脂质体抗纤维化剂量探索：BDL小鼠分为NS，Lip-Zn0.2mgZn2+/kg，Lip-Zn1mgZn2+/kg，Lip-Zn5mgZn2+/kg组，各组进行尾静脉处理，隔天一次，共2周；Sham组和BDL+NS组给予相同体积的生理盐水；处理结束后取材，AAS检测肝组织锌浓度；通过金标准HE和SR染色评价锌脂质体对小鼠抗肝纤维作用；并定量检测肝组织羟脯氨酸含量。锌脂质体与锌溶液抗纤维化效果比较：BDL小鼠分为Pre-treatment，NS，Zn，Lip-Zn组：Pre-treatment为干预前对照组，即4周终点取材；锌溶液（Zn）组将硫酸锌溶液以5mgZn2+/kg剂量灌胃处理2周，每天一次；其余组处理与前述相同。通过比较小鼠存活情况；AAS检测肝组织锌浓度；HE和SR染色，肝组织羟脯氨酸含量；血清中TBIL，ALT和AST来反映锌脂质体和锌溶液抗肝纤维作用的差异。 （3）锌脂质体对胆汁淤积性肝纤维化小鼠的作用机制：干预结束后，进行三方面检测：肝脏胶原合成相关分子，通过qRT-PCR和免疫组化检测小鼠肝组织α-SMA的表达及定位，通过qRT-PCR检测I、Ⅲ型胶原的合成水平；肝脏胶原降解相关分子，检测基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase，MMP），包括MMP9和MMP12，以及基质金属蛋白酶抑制剂1（Tissueinhibitorofmetalloproteinase1，TIMP1）的基因表达情况；肝脏胶原交联相关分子，通过免疫组化和qRT-PCR分别检测小鼠肝组织赖氨酰氧化酶（Lysyloxidase，LOX）蛋白表达和定位和基因表达情况。 6.锌脂质体对肝纤维化恒河猴的作用。 （1）胆汁淤积性肝纤维化恒河猴模型的建立：通过BDL构建胆汁淤积性肝纤维化恒河猴模型，术前作为正常对照组；BDL手术2个月后，经超声引导肝脏穿刺活检获得肝组织，石蜡包埋切片后进行HE染色和SR染色，统计CPA，常规生化检测TBIL，ALT，AST。 （2）锌脂质体对胆汁淤积性肝纤维化恒河猴的作用：对于恒河猴这样的大型动物模型，不适宜一次性大规模筛选剂量，我们根据前面小鼠干预效果最优剂量，折算猴的给予剂量，选择0.35mgZn2+/kg作为优先尝试的剂量，静脉注射，隔天一次，干预4个月。然后成倍递增至0.7mgZn2+/kg，1.4mgZn2+/kg进行相同干预。所有肝组织样品均通过经超声引导肝脏穿刺活检取得。干预结束后，通过两方面来评价锌脂质体对恒河猴抗肝纤维作用：病理组织学金标准HE和SR染色及其统计结果评价肝脏病理变化及肝纤维化的进展情况；生化仪检测血清中TBIL，ALT和AST。 结果： 1.锌脂质体的表征。透射电镜图像显示锌脂质体颗粒形态呈球形或类球形结构，大小均一，外观圆整；平均粒径为130nm，粒径分布在90-150nm；包封率高于90%；无明显突释效应。 2.锌脂质体安全剂量的探索。5mgZn2+/kg及以下剂量锌脂质体生存率为100%，体重变化率观察期间均上升，且无任何毒性表现。 3.脂质体主要将锌递送至肝脏。给予了锌脂质体的小鼠的心、肺、肾和脑的锌浓度无显著变化，仅肝脏中的锌浓度明显增加。 4.脂质体对药物肝脏保留时间的影响。脂质体载体递送锌，肝脏中锌保留时间可达48h。 5.锌脂质体逆转小鼠胆汁淤积性肝纤维化的作用及机制。（1）胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型构建成功：组织病理学结果显示BDL组小鼠的肝组织形态结构异常和胶原沉积增加，且BDL术后4周已进入肝硬化早期，即临床上肝纤维化到达不易逆转的程度；大体变化显示BDL组小鼠皮肤和肝脏黄染，肝重体重比增加；血清学指标显示BDL组小鼠TBIL、ALT和AST均增加。（2）锌脂质体逆转小鼠胆汁淤积性肝纤维化：1mgZn2+/kg锌脂质体可明显改善肝组织形态结构，且1mgZn2+/kg比0.2mgZn2+/kg和5mgZn2+/kg剂量组更有效减少肝脏内胶原纤维的分布和胶原蛋白含量；与NS组相比，Zn和Lip-Zn干预组的肝脏无明显局灶性坏死，METAVIR评分降低，胶原分布和含量减少，而只有Lip-Zn干预组小鼠存活率提高，ALT和AST酶活均降低；与Pre-treatment组相比，只有Lip-Zn干预组METAVIR评分降低，胶原分布和含量减少，ALT酶活降低。（3）锌脂质体对小鼠胆汁淤积性肝纤维化的机制：锌脂质体干预减少了小鼠肝组织α-SMA阳性的细胞数量，α-SMA的基因表达显著降低，以及I、Ⅲ型胶原的合成水平也显著降低；锌脂质体干预后MMP12表达减少，MMP9未改变，TIMP1表达显著降低；锌脂质体干预后，肝脏胶原交联相关酶LOX蛋白及基因表达减少，汇管区LOX分布减少。 6.锌脂质体对胆汁淤积性肝纤维化恒河猴的作用。（1）胆汁淤积性肝纤维化恒河猴模型构建成功，HE染色，SR染色及CPA均显示BDL组恒河猴已形成显著肝纤维化，甚至肝硬化早期。（2）锌脂质体对恒河猴胆汁淤积性肝纤维化的作用：与干预前的自身相比，只有1.4mgZn2+/kg剂量锌脂质体干预后，炎性细胞浸润减少，肝组织门管区结构扩大现象减少，胶原含量减少，血清学指标酶活降低。 结论： 1.锌脂质体制备成功，其能有效且特异将锌递送至肝脏中。 2.锌脂质体不仅抑制肝纤维化的进程，还能逆转肝纤维化；抗肝纤维化效果优于锌溶液。 3.锌脂质体抗纤维化有效且优于锌溶液可能通过减少肝星状细胞的活化，进而减少胶原的合成；同时减少肝组织内胶原交联共同实现。
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