摘要
骨组织工程构建的人工骨是目前最有希望实现完美骨修复的植入体。生长因子具有信息传递、指导生理修复作用，是构建活性人工骨不可或缺的因子。但目前外源性生长因子使用暴露出种种缺点，严重限制了其应用。除了多种生长因子协同效应外，人体自然骨生长过程中同时涉及大量生物活性离子协同调控，并且这些生物活性离子对骨代谢、生长和发育是必不可少的。这些功能性生物活性离子在骨再生修复时可发挥出类似生长因子效能，或刺激细胞表达生长因子，促进骨再生修复。近些年，在骨再生修复领域中，具有特定功能的生物活性离子已取得良好促骨修复效果，并成为骨组织工程领域的研究热点。 五价钒（V(V)）是一种类胰岛素生长因子的类似物，同时也是生物元素磷（P）的结构类似物，对蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPases）具有更强的抑制效应，表现出应用于骨再生修复的巨大潜能。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨修复中各类成骨相关细胞的重要前体细胞，在修复过程中由各类生长因子诱导分化成各种功能性细胞发挥效能，完成骨修复。因此探究BMSCs的成骨效应对骨再生修复具有重要意义。 本论文首先以骨髓间充质干细胞BMSCs为模型，系统探究V(V)离子对BMSCs增殖与成骨分化的影响，探讨其相关分子信号通路。然后采用水热法将V(V)离子掺入介孔生物活性玻璃MBG，制备V(V)掺杂MBG材料（V-MBG），系统考察V(V)掺入对MBG形貌、结构参数影响以及不同离子从V-MBG中释放的溶出行为，同时探究V-MBG材料的体内外成骨效应及分子机制。在此基础上，以MBG作为生物活性成分，与可降解聚乙醇酸-聚己内酯（PGA-PCL）聚合物材料构建MBG/PGA-PCL复合支架，探究该支架用作骨组织工程支架的可行性；进行MBG/PGA-PCL支架及V-MBG/PGA-PCL支架用于骨缺损修复用的骨组织工程支架的体内动物骨修复评价，从而实现V(V)离子应用于骨再生修复的目的。本论文的主要研究内容与研究结果如下： （1）以小鼠骨髓间充质干细胞rBMSCs为模型，采用含不同浓度V(V)离子培养基对rBMSCs进行孵育，考察V(V)离子对rBMSCs增殖、成骨分化的影响，利用RNA-seq技术筛选这种成骨效应中相关分子信号通路，并进行验证。实验结果显示，V(V)离子促rBMSCs增殖及成骨分化具有浓度依赖性和时效性，当V(V)离子浓度≤5μmol/L(μM)时，在培养3~4天时V(V)离子具有最优促增殖效应，而当浓度≥12μM时表现出对细胞增殖的抑制；0.01~5μM浓度的V(V)离子可诱导rBMSCs向成骨细胞转化，表现出成骨诱导性；0.01~5μM浓度的V(V)离子主要促进rBMSCs早、中期成骨分化，但对后期成骨分化以及成骨矿化作用较弱。V(V)离子对rBMSCs成骨诱导性以及促成骨分化效应与Itga2b-FAK-MAPK(ERK1/2、pERK1/2和pP38)和Itga2b-FAK-PI3K(Akt)这两条信号通路密切相关。 （2）利用水热法制备V-MBG材料，系统探究V(V)掺入对MBG形貌和介孔结构参数的影响以及V(V)物种在V-MBG化学状态。同时从合成体系中V(V)离子对P123胶束自组装、P123胶束与硅物种间协同组装影响以及V(V)物种在V-MBG化学状态等方面系统探究V(V)离子对V-MBG形貌和介孔结构影响的机理。 结果显示，①V(V)掺入对合成V-MBG的形貌以及介孔结构特征产生了较显著影响，并且随着掺入V(V)量增加，影响效应增强；钒酸根加入合成体系后会诱发“盐溶效应”和“酸降效应”，最终导致合成过程中P123胶束/硅聚合物组装体更大的粒径尺寸和煅烧后V-MBG单颗粒更小的宏观粒径尺寸，以及整体下降的介孔结构参数（比表面积、介孔孔径、孔体积和壁厚）。②在V-MBG中，V(V)物种主要有三种不同配位形式：孤立正四面体VO43-型配位、孤立正四面体(SiO)3V=O配位以及聚合四面体或者八面体型配位。这三种配位形式分别对应于三种形式钒物种，依次是无定型钒酸钙团簇（VO43-型配位），主要存在于介孔孔壁内外表面；孤立四面体配位（(SiO)3V=O）钒物种，主要嵌入到V-MBG硅网络结构内部；聚合四面体或者八面体型配位的聚合V-O-V钒物种，主要形成于V-MBG表面。这三种钒物种的分布形式及含量也对V-MBG的形貌和介孔结构产生一定程度上影响。这些结果为调控V(V)离子从V-MBG中溶出行为及发挥效应的实际浓度奠定了良好基础。 （3）以去离子水（DW）和模拟人工体液（SBF）为浸出介质，考察V-MBG在不同介质中的离子溶出行为，并结合结构和溶出环境因素探讨V-MBG中这些离子的溶出规律及影响溶出行为的相关机理。离子溶出规律结果显示：①整体来看，在溶出介质（去离子水和SBF）中，从V-MBG溶出的Si、Ca、P离子浓度呈上升-下降-趋于平稳的变化规律；随掺入量的增加，V(V)掺入对钙硅磷离子溶出的影响逐渐增大；②V(V)离子在溶出介质中呈突-缓释放规律，主要以缓释为主，并且不同时间点V(V)离子溶出量正相关于其掺入量；在第21天，在DW中，1.0V-MBG、4.0V-MBG和10.0V-MBG释放的V离子浓度依次约为1.1mg/L、5.8mg/L、12.5mg/L；在SBF中依次约为1.6mg/L、4.8mg/L和12.8mg/L。③V(V)掺入后引起V-MBG结构稳定性下降及表面形成的羟基磷灰石主要决定了Si、Ca、P和V(V)离子溶出行为。不同的溶出介质环境也对这些离子溶出行为产生了重要影响。 （4）以rBMSCs为模型细胞，在体外系统研究V-MBG浸提液（含V(V)、Si、Ca和P离子）对rBMSCs的促增殖、成骨分化效应，并筛选最优促成骨效应的V(V)、Si、Ca、P离子浓度配比。此外，验证了Itga2b-FAK-MAPK信号通路在这些离子协同促成骨的作用。体外细胞结果显示，一定浓度范围内，V-MBG浸提液对rBMSCs表现出优异的骨诱导性，并促进了rBMSCs增殖及成骨早、中期分化，其中浸提液V(V)浓度为19.4μM时，促进效应最为显著。V-MBG浸提液的促成骨效应主要取决于V(V)离子和Si、Ca、P离子的协同效应，其中V(V)离子在这种协同效应起主导作用，这种主导效应具有浓度依赖性和时效性。Itga2b-FAK-MAPK(pERK1/2)信号通路在V(V)离子和Si、Ca、P离子的协同促成骨效应中发挥重要作用。 （5）MBG/PGA-PCL复合支架的制备及体内外成骨促进效应验证。通过体外加工性能评价与体内降解实验对PGA-PCL基质材料体系进行优化，将MBG与降解可调控PGA-PCL聚合物制备出MBG/PGA-PCL复合材料，同时采用溶剂浇铸-颗粒沥滤法制备MBG/PGA-PCL支架，重点系统考察MBG/PGA-PCL复合支架作为骨修复支架的可行性。在此基础上，制备V-MBG/PGA-PCL支架，并考察其体内骨修复效果。实验结果显示：①当PGA和PCL比例为30/70（质量比），分子量为21万左右的PGA-PCL基质材料制备支架成型性更好，且体内降解速率更符合骨生长速率；②MBG均匀分散于MBG/PGA-PCL复合材料和支架中，MBG/PGA-PCL支架具有贯通的孔道，孔径300~450μm，孔隙率约为80%；MBG掺入提高MBG/PGA-PCL复合支架的亲水性，并诱导支架表面形成羟基磷灰石，提高了MBG/PGA-PCL支架的生物活性；MBG加入提高了MBG/PGA-PCL支架的体内外降解速率；可通过调控MBG添加量来调控MBG/PGA-PCL支架材料的降解速率；③体外细胞结果表明，MBG/PGA-PCL支架支撑rBMSCs的粘附、生长和增殖，MBG掺入提高了复合支架的细胞相容性，同时促进了rBMSCs成骨分化；PGC/M40支架表现出最优的细胞相容性和促成骨分化能力；④体内骨修复结果表明，MBG掺入促进了新生骨组织形成，表现出更优的成骨效果。其中PGC/M40支架展现出最优的骨修复效果；V(V)的掺入进一步提高了长入支架内部的新生骨量，PGC/V-25和PGC/V-40支架材料具有最优体内骨修复效果。 综上所述，本论文证明了一定浓度范围内V(V)离子可促进rBMSCs增殖和成骨分化，并且可促进rBMSCs向成骨转化，同时阐明了这种促进效应的分子机制；制备了V-MBG材料，并阐明了V(V)对V-MBG形貌和介孔结构影响及相应机理，系统评价了V-MBG中各活性离子溶出规律；制备了V-MBG/PGA-PCL复合支架，并验证了其作为骨组织工程支架的可行性、有效性和安全性。总体来讲，本论文证实了V(V)离子在骨再生修复领域中应用的潜能，研发了V-MBG/PGA-PCL骨组织工程支架，对新型骨组织工程修复体的研究开发与临床应用提供了一条新的思路。
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